科研| CELL DEATH DIS：癌症相关成纤维细胞的脂质代谢重编程增强了结直肠癌细胞的迁移（国人佳作）
编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。
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癌症相关成纤维细胞(CAFs)与结直肠癌(CRC)细胞之间的代谢相互作用在CRC发展中起着重要作用。然而，关于脂质在CAFs中的变化以及这些代谢重编程如何影响CRC细胞转移的研究甚少。本文中，我们发现与正常成纤维细胞相比，CAFs的条件培养基(CM)可以促进CRC细胞的迁移。CAFs经过脂质体重编程会积累更多的脂肪酸和磷脂。CAFs的CM在蛋白质缺少时仍能促进CRC细胞的迁移，这说明CAFs CM中的小分子代谢物促进CRC细胞迁移。然后，我们证实了CRC细胞吸收CAFs分泌的脂质代谢物。脂肪酸合成酶(FASN)是脂肪酸合成的关键酶，在CAFs中显著增加。通过siRNA干扰FASN或者减少CRC细胞对脂肪酸的摄取可以消除CAF诱导的CRC细胞迁移。综上所述，我们的研究结果为CRC转移的机制研究提供了一个新的视角并提出CAFs的FASN或CRC细胞的CD36可能是未来治疗CRC转移的潜在靶点。
论文ID
原名：Reprogramming of lipid metabolism in cancer-associated fibroblasts potentiates migration of colorectal cancer cells
译名：癌症相关成纤维细胞的脂质代谢重编程增强了结直肠癌细胞的迁移
期刊：Cell Death & Disease
IF：5.959
发表时间：2020.4.23
通讯作者：赵瀛兰
通讯作者单位：四川大学华西医院
实验设计
实验结果
1. NFs和CAFs的特性描述
利用α-SMA的免疫组化染色(IHC)验证肿瘤微环境(TME)中成纤维细胞的丰度，结果表明CRC组织中α-SMA表达高于邻近正常组织(NATs)中的，这表明在CRC组织中成纤维细胞更丰富(图1A)。从新鲜CRC组织中分离得到的正常成纤维细胞(NFs)和CAFs呈纺锤形(图1B)。免疫荧光结果表明，在NFs和CAFs中Vimentin与α-SMA表达上调，而细胞角蛋白表达下调(图1C)。此外, 与NFs相比，α-SMA在CAFs中过表达，说明CAFs比NFs更活跃。通过qRT-PCR和western blot进一步证实成纤维细胞标志物的表达。结果表明，CAFs中α-SMA的mRNA水平和蛋白水平均明显高于NFs中的(图1D, E)。总之，这些数据表明我们成功地从CRC样本中分离出了高纯度的NFs和CAFs。
2. CAFs促进CRC细胞迁移
为了研究CAFs对CRC细胞的影响，我们首先采用MTT法检测CAFs对CRC细胞增殖的影响。结果表明，CAFs的条件培养基(CM)和NFs的CM均促进CRC增殖，但CAFs的CM和NFs的CM两者之间无显著性差异(补充图1A)。然后，我们探讨了CAFs对CRC细胞迁移的影响。首先，我们通过检测E-cadherin与Vimentin的比值来确认CRC细胞的转移能力，因为E-cadherin和Vimentin是重要的EMT标志物。结果显示，DLD1中细胞E-cadherin/Vimentin比值较高，说明DLD1细胞转移能力偏低(补充图1B)。因此，我们选择DLD1细胞来检测CAFs对细胞迁移的影响。Transwell实验和伤口愈合实验表明，与NFs CM和DLD1 CM相比，CAFs CM显著增强了DLD1细胞的迁移(补充图2A-C)。免疫荧光结果显示CAFs CM处理后，DLD1细胞中Vimentin表达增加，而E-cadherin表达减少(补充图2D)。然后我们检测了DLD1细胞在CAFs CM治疗后转移相关基因的mRNA表达情况。结果表明，CAFs CM可以提高Vimentin、MMP2、MMP9、Snail的mRNA表达，而NFs CM则不能(补充图2E)。同时，western blot分析显示，CAFs CM增强了DLD1细胞中Vimentin的表达，降低了E-cadherin的表达，而NFs CM不会(补充图2F)。综上所述，这些数据表明CAFs促进DLD1细胞迁移。
3. CAFs经历脂质重编程
之前的研究已经报道了CRC的CAFs可以增强糖酵解。然而，关于CAFs的脂质组学的研究较少。为了探讨CAFs的脂质代谢变化及其是否促进CRC细胞迁移，我们利用基于脂质组学的UPLC-Q-TOF/MS分析检测CAFs和NFs及其CM的脂质图谱。CAFs CM的脂质组学特征与NFs CM的存在显著性差异。热图显示，大部分的磷脂、脂肪酰基和胆固醇酯(CE)在CAFs CM中升高(图2A, B)。脂类统计结果显示，在92种发生变化的脂类中，脂类酰基所占比例最大，为44%(图2C)。通过对脂类酰基结构的深入分析，发现大部分发生变化的脂类酰基是具有较长且多不饱和碳链的脂类(图2E-H)。进一步分析脂类代谢产物，发现脂肪酸、双甘油酯(DGs)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、LPC和磷脂酰乙醇胺(PE)显著升高(图2D)。同时，CAFs和NFs的脂质组学分析显示CAFs中的脂类酰基含量高于NFs中。综上所述，这些数据表明CAFs经历了脂质体重编程，并且与NFs相比，排出更多的脂肪酰基和磷脂。
4. CAFs CM中的小分子代谢物诱导CRC细胞迁移
细胞外细胞因子可增强肿瘤细胞的迁移能力，而脂质摄取可修饰与细胞运动密切相关的质膜。因此，我们推测CAFs可能通过脂类代谢产物而促进CRC细胞的迁移。为了证明我们的推测，我们用三个冻融循环来破坏CM中大分子蛋白，然后用3-kD过滤器过滤掉。我们观察到在伤口愈合实验(图3A, C)和transwell迁移实验(图3B, C)中，大分子蛋白被去除后CAFs CM仍能增强DLD1的迁移能力，但NFs CM不能。免疫荧光结果显示，经蛋白过滤的CAFs CM处理后，DLD1中Vimentin表达增加，而E-cadherin表达减少(图3D)。此外，大分子蛋白被去除后的CAFs CM在mRNA水平和蛋白水平上增强Vimentin的表达，降低E-cadherin的表达(图3E, F)。这些结果说明诱导DLD1迁移的因子应该体积小并缺乏三级结构，提示这些因子可能是代谢物。因此，在接下来的实验中，我们使用去除大分子蛋白的CAFs CM。
5. CAFs分泌的脂质代谢物被CRC细胞吸收
为了进一步验证我们的假设，我们接下来进行了一系列的代谢组学研究来验证是否DLD1细胞吸收CAFs分泌的代谢物(图4A)。具体来说，我们寻找的分子是在CAFs CM中过度表达的分子(由CAFs分泌)；与DLD1细胞接触后CAFs CM中代表性不足的分子(被DLD1细胞去除)；与CAFs CM共培养的DLD1细胞中大量表达的分子(被DLD1细胞吸收)。在分析的约200种代谢物中，我们发现19种脂类遵循这一模式，包括5种脂肪酰基、5种甘油脂类(GL)、8种甘油磷脂(GP)和1种CE(图4B)。接下来，我们分析了与CAFs CM共培养的DLD1细胞和与DLD1 CM共培养的DLD1细胞之间的差异脂质代谢产物。结果显示CAFs CM处理后脂类明显升高，包括PC、PE、磷脂酰丝氨酸、PI、磷脂酸(PA)、DG、甘油三酯(TG) (图5A)。统计结果表明，GP和GL通路中的脂类代谢产物(均为脂肪酸的下游代谢产物)在DLD1细胞中约占所有发生变化脂类的69%，然而脂肪酰基仅仅约占12%(图5B)。然后，我们深入分析了这些变化的GPs和GLs中碳链的长度和不饱和度。有趣的是，这些GPs和GLs中大部分具有较长且多不饱和的碳链(图5C-F)，这与CAF CM中脂肪酰基增加的模式相一致(图2D)。这些结果表明，DLD1可以利用来自CAFs的脂肪酰基作为脂类合成的资源。
6. 在CAFs中FASN的下调或抑制FA的摄取降低了CRC细胞的迁移
根据CAFs和NFs的CM中脂质组学的特征差异(图2A, B)，我们检测了脂肪酸从头合成途径、脂肪酸分解代谢途径和磷脂合成途径中代谢酶的mRNA水平(图6A)，结果显示CAFs中脂肪酸合成酶(FASN)显著升高，大部分降解酶类明显降低(图6A, B)，说明CAFs中积累了较多的脂肪酸。这些结果与CM中脂肪酸增加的趋势一致(图2A, B)。FASN是脂肪酸合成的关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成脂肪酸。然后我们检测了间质FASN在CRC组织和NATs中的表达。免疫荧光结果显示CRC组织中间质FASN的水平高于NATs中的(图6C)。
因此，我们通过siRNA敲低CAFs中FASN的表达(图7E)。敲低FASN降低了CAFs中脂肪酸的产量，进而降低了脂肪酸下游被DLD1细胞所吸收的脂质代谢产物。伤口愈合实验(图7A, C)和transwell实验(图7B, C)显示，来自siFASN CAFs的CM可减弱DLD1细胞的迁移与来自siNC CAFs的CM对照组相比。此外，CAF CM诱导DLD1细胞中E -cadherin减少，Vimentin增加，但当CAFs中敲低FASN后这些变化被恢复(图7D, E)。我们还发现，敲低FASN后降低了CAFs中α-SMA水平(图7E)。这些结果证实了在CAFs中siFASN降低DLD1细胞的迁移能力，说明FASN是CAFs中的关键酶。
为了进一步证实CAFs分泌的脂肪酸促进CRC细胞迁移的结果，我们使用CD36的抑制剂磺酸-N-琥珀酰亚油酸盐(SSO)，它是细胞表面最重要的脂肪酸转运体。采用50 μM SSO治疗CRC细胞4 h，transwell实验(图7F, G)显示SSO可降低CAF CM诱导的DLD1和HCT-15细胞的迁移。这些数据表明，从CAFs分泌的脂肪酸有助于CRC细胞的体外转移。
为了评价CAFs在体内促进转移的作用，将DLD1细胞(1×106)与等量的CAFs或NFs混合或不混合，注射入7周龄雌性裸鼠的脾脏。给小鼠注射DLD1和CAFs后腹腔注射PBS或CD36单克隆抗体(JC63.1)，已报道JC63.1可以阻断体内脂肪酸摄取。正如预期的那样，注射DLD1和CAFs混合物的小鼠比其他小鼠在肝脏中有更多的转移性结节。CD36缺失后减少了小鼠肝脏的转移(图8A)。苏木精和伊红(H&E)染色进一步表明，小鼠注射DLD1和CAFs混合物与其他组相比在肝脏中有更多的转移，而CD36缺失后减少了转移(图8B)。这些数据表明，CAFs分泌的脂肪酸有助于CRC细胞在体内的转移。
总体而言，我们的数据表明CAFs分泌脂肪酸，被CRC细胞吸收，用于合成其他脂质，进而促进CRC细胞的迁移(图8C)。
结论
综上所述，我们的结果证实了CAFs和CRCs之间新的脂质互动作用，并且这种脂质影响CRC转移。更重要的是发现了CRC中一个从未被重视的脂质组学网络，它为临床治疗转移提供了新的研究方向和潜在靶点。CRCs利用CAFs分泌的脂质而增强其转移能力的机制值得进一步研究。
原文网址：https://doi.org/10.1038/s41419-020-2434-z