科研 | Wan-Uk Kim & Daehee Hwang：动态转录组分析揭示了慢性炎症性关节炎的关键促消退因素
编译：小鹿同学，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名: Dynamic transcriptome analysis unveils key pro-resolving factors of chronic inflammatory arthritis
译名: 动态转录组分析揭示了慢性炎症性关节炎的关键促消退因素
期刊: The Journal of Clinical Investigation
IF: 11.864
发表时间: 2020.6.22
通讯作者: Daehee Hwang & Wan-Uk Kim
通讯作者单位: 韩国首尔国立大学生物科学系&韩国天主教大学医学院风湿免疫科内科
DOI号: https://doi.org/10.1172/JCI126866
实验设计
结果
胶原诱导性关节炎（CIA）进展过程中滑膜组织的动态转录组分析
为了表征CIA的炎症阶段，研究者首先测量了关节炎得分的时序变化，以监测注射完全弗氏佐剂（CFA）和II型胶原（CII）后15周内的临床严重程度。关节炎在第4周开始诱发，在9周达到高峰，但在15周后自发消退（图1A），这类似于先前的报道。为了确认炎症的消退，研究者在免疫（非免疫）前和免疫后的诱发时期（6周）、高峰时期（9周）以及消退时期（15周）的关节组织中测量了促炎性细胞因子（Ptgs2、Il6和Il1b）和抗炎性细胞因子（Il4、Il10和Tgfb1）的mRNA表达水平（图1B）。研究者发现与非免疫时期和诱发阶段相比，高峰时期内Ptgs2、Il6和Il1b的mRNA表达水平显著增加。相反，在高峰时期和消退时期之间，Ptgs2和Il6的mRNA水平显著下降，表明促炎性反应受到抑制。同时，与非免疫时期和诱发时期相比，抗炎性Il4、Il10和Tgfb1的表达水平在消退阶段显示出明显的上调，表明抗炎性反应的增强；Il4、Il10和Tgfb1在消退阶段的平均表达水平分别比免疫前阶段的表达水平高3.7倍、11.4倍和7.0倍，比诱发阶段的表达水平高3.0倍、2.5倍和2.6倍，并仍显著高于高峰时期的表达水平。研究者接下来对来自CIA小鼠的关节组织分别在诱发时期、高峰时期和消退时期进行了基因表达谱的分析。已知与抑制免疫细胞浸润、凋亡性免疫细胞的清除、巨噬细胞活化或组织修复有关的消退相关基因在消退阶段上调或下调。此外，使用CIBERSORT方法评估CIA进展过程中各种免疫细胞活性的动态变化显示，与其它免疫细胞相比，Treg细胞和M2巨噬细胞（已知参与消退阶段）在消退时期显著（p <0.05）增加，这一点也通过两个抑制性免疫细胞中标记基因表达水平的增加而证实。所有这些数据都支持了研究者进行全局分析的有效性。
图1. 与CIA消退相关的基因动态表达变化以及细胞进程。（A）在CIA进展过程中，每两天进行一次关节炎得分评估（底部）。数据表示为平均值±SEM（每个时间点小鼠n=8）。诱导期（I）、高峰期（P）和消退期（R）（分别是6周、9周和15周）使用箭头标明。图中展示了三个时期中代表性关节炎的关节（顶部）。（B）在免疫前和免疫后的I、P和R时期对促炎性细胞因子（Ptgs2、Il6和Il1b）和抗炎性细胞因子（Il4、Il10和Tgfb1）进行定量实时荧光聚合酶链反应（qRT-PCR）测定。使用箱线图展示四个时期中（每个时期中n=4~8）每个基因的表达水平。（C）与消退相关的基因簇（C1-C6）（热图中的柱形）。颜色代表簇中基因的上调（红色）和下调（蓝色）。对于每种条件下的两个重复，图中展示了来自P/I（第1行和第2行）和R/P（第3行和第4行）的比较中基因的log2倍变化。括号中的U、D和N分别表示上调、下调和没有变化；比如UN（对于C1簇）表示在P/I的比较中上调，在R/P的比较中没有表达变化。括号内的数字表示每个簇中DEGs的数目。（D）C1-C6中基因的GOBPs富集。彩条表示由Z=N-1（1-p）定义的Z-得分梯度（富集的显著性），其中N-1（▪）是逆标准正态分布，p是富集程度的p值。（E）代表性基因的qRT-PCR分析。对于qRT-PCR分析，每个基因的mRNA表达水平（每组中n≥8）使用2-ΔΔCt的方法以磷酸甘油醛脱氢酶（Gapdh）为内参进行标准化。箱子表示了最低、中部和最高的四分位数；晶须代表了最小和最大值。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001通过事后检验（Tukey校正；图B）的单因素方差分析或Student’ t检验（图E）得到。
与CIA消退相关的免疫细胞的细胞进程
为了鉴定和表征与消退相关的基因，研究者接下来从高峰期与诱发期（P/I）和消退期与高峰期（R/P）的比较中分别选择了1795个（P/I）和1881个（R/P）差异表达基因（DEGs）。然后，研究者选择DEGs的六个簇（C1-6），其中有在消退阶段显示了上调（C3和C5）和下调（C2和C4），以及在高峰阶段显示上调和下调，也有在消退阶段趋于稳定的簇（图1C）。基因本体生物学过程（GOBPs）的富集分析表明，C3和C5分别显著（p <0.01）代表了T细胞的分化/激活和巨噬细胞（NFκB信号传导）的功能，而C6显著（p≤0.05）代表了巨噬细胞和骨髓白细胞的激活（图1D）。参与T细胞功能的DEGs网络分析模型显示了CIA进程中TGFβ、JAK-STAT和TCR信号传导的激活。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析证实了在消退阶段有四个基因出现了上调，这些基因与TGFβ（Smad4）、JAK-STAT（Foxp3）和TCR（Malt1和Nfatc3）的信号传导相关（图1E）。这些数据表明，多种免疫细胞（包括T细胞和巨噬细胞）内的细胞途径共同有助于CIA的消退。
基于网络分析选择关键调节因子以实现CIA的消退
为了确定关键的消退调节因子，研究者使用蛋白质间相互作用从P/I和R/P的比较中构建了2836个DEGs的与消退相关的网络分析模型。然后，根据以下标准，即：（a）在消退相关的网络中发挥重要作用的核心分子（p <0.05），（b）与T细胞和/或巨噬细胞激活而等功能性相关的分泌型抗炎性调节子，研究者选择了三个关键调节因子，包括整合素β1亚基（Itgb1）、C3中的酪氨酸-3/色氨酸-5单加氧酶激活蛋白ζ（Ywhaz）和C5中的核糖体蛋白S3（Rps3）。接下来，通过使用qRT-PCR，研究者证实与高峰阶段相比，Itgb1、Rps3和Ywhaz在消退阶段出现上调（图2A）。研究者接着通过免疫组织化学技术（图2B）和Western印迹法（图2C）检查了它们在小鼠滑膜组织中的蛋白表达。正如预期所料，两个实验均显示消退时期滑膜组织内三种蛋白质的表达水平均明显高于高峰时期的水平。在CIA大鼠模型中证实了Itgb1、Rps3和Ywhaz的表达增加（图2D），这表明与CIA消退相关的这些基因在其它哺乳动物种类中是保守存在的。
图2.CIA消退的关键调节因子。（A和B）与高峰期（P）相比，在消退期（R）的小鼠滑膜组织中通过qRT-PCR（n=6）和免疫组织化学技术（n=6）（比例尺：200μm）分别检测三个关键调节因子（Itgb1、Rps3和Ywhaz），发现其mRNA（A）和蛋白质（B）的表达增加。对于qRT-PCR，Gapdh的mRNA水平作为内参。（C）小鼠滑膜组织中（每组中小鼠n=4）Itgb1、Rps3和Ywhaz的Western印迹分析。（D）与P时期相比，小鼠滑膜组织（每组中小鼠n=6）在R时期通过Western印迹分析法检测到Itgb1、Rps3和Ywhaz的蛋白表达增加。对于Western印迹分析，蛋白质的表达水平使用β-肌动蛋白（作为内参）进行标准化。箱子代表了最低、中部和最高的四分位数，晶须代表了最小值和最大值。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001通过Student’ t检验得到。
Itgb1、Rps3和Ywhaz在调节性T细胞和M2巨噬细胞中主要表达
研究者进行了下一个实验，以确定在消退阶段哪种类型的免疫细胞中Itgb1、Rps3和Ywhaz的表达增加。研究者推测Itgb1、Rps3和Ywhaz的上调可能源于消退阶段中表达这些分子的免疫细胞激活。为了解决这个问题，研究者调查了三种选定的关键调节因子是否在激活后的B细胞、巨噬细胞或T细胞中表达及上调。实际上，研究者通过流式细胞术确定当使用抗CD3/28抗体、抗IgM抗体和脂多糖（LPS）分别处理激活CD4+和CD8+ T细胞、B细胞和巨噬细胞时，其中的Itgb1、Rps3和Ywhaz会出现上调。与使用对照siRNAs处理的CD4+ T细胞相比，靶基因siRNAs处理的CD4+ T细胞中调节因子的显著降低证实了研究者所使用抗体的特异性。
基因表达分析表明T细胞和巨噬细胞的亚群（尤其是Treg细胞和M2巨噬细胞）与CIA的消退有关。因此，研究者首先使用三个关键调控因子调查了T细胞亚群及其与消退之间的关系。在CD4+ T辅助（Th）细胞的各种亚型中，Treg细胞在抑制慢性炎症中起主要作用。因此，研究者检查了CD4+ T辅助细胞的四种亚型（Th1、Th2、Th17和Treg）中三种调节因子的表达水平，结果发现它们在这四种亚型中均有表达（图3A-C）。然而，研究者通过流式细胞术和qRT-PCR观察到与其它类型的Th细胞相比，Treg细胞中Itgb1、Rps3和Ywhaz的表达水平最高；Th17细胞显示出第二高的表达水平（图3A-3C）。值得注意的是，Ywhaz在Treg细胞中的表达非常高，要高于在Th17细胞中的表达水平（图3A-3C）。Western印迹分析也证实了Treg细胞中Itgb1、Rps3和Ywhaz蛋白的表达高于Th1细胞内的水平（图3D）。有趣的是，最近有研究发现Ywhaz是存在于外泌体中的前十种蛋白之一，并且来自肿瘤细胞的外泌体Ywhaz可以传播到浸润肿瘤的T细胞内，从而削弱其抗肿瘤活性。为了评估外泌体的Ywhaz，研究者分离了来自Treg细胞的外泌体，并证实了Ywhaz蛋白与CD63（一种外泌体标记）的共表达（图3E），这表明Ywhaz可能从Treg细胞向邻近免疫细胞进行外泌体传播。总之，这些数据表明这三种调节因子可能与Treg细胞相关，从而有助于CIA中的炎症消退。
图3.T细胞中三个关键调节因子（Itgb1、Rps3和Ywhaz）的表达。（A）在小鼠中分离得到CD4+ T辅助细胞的未分化亚型和分化亚型中三种调节因子的基因表达水平。根据转录因子和/或细胞因子的表达模式来定义Th细胞的亚群：Tbx21和Ifng代表Th1细胞、Gata3代表Th2细胞、Rorc和Il17代表Th17细胞、Foxp3代表Treg细胞。目标基因的mRNA表达水平通过Gapdh的表达水平（作为内参）进行标准化。（B和C）通过流式细胞术确定CD4+ T辅助细胞亚型中Itgb1、Rps3和Ywhaz蛋白的表达水平，并使用重叠直方图（B）和平均荧光强度（MFI）（C）来表示。在胞内细胞因子染色之前，将分化的Th细胞使用PMA/离子霉素再刺激4小时。灰色直方图表示同型对照（Iso）。数据使用典型数据（B）或三个独立实验的平均值±SEM（A和C）表示。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001通过事后检验（Tukey校正）的单因素方差分析确定。（D）Th1细胞和Treg细胞中Itgb1、Rps3和Ywhaz的Western印迹分析。数据是三次结果相似独立实验的代表。（E）Western印迹分析显示：Ywhaz和Bcl2在细胞裂解物中进行共表达或Ywhaz和CD63在由Treg细胞分离的外泌体中共表达（n＝3）。
巨噬细胞是参与炎症发展或消退的另一种重要的免疫细胞，根据周围的微环境，巨噬细胞可分化为促炎性巨噬细胞（M1）或抗炎性巨噬细胞（M2）。为了确定Itgb1、Rps3和Ywhaz是否在巨噬细胞中表达，研究者首先通过CD68和每种调节因子的免疫荧光双重染色法检查了它们在滑膜巨噬细胞中的表达。研究者观察到表达CD68和每个调节因子的细胞存在显著共定位（图4A），这表明CIA关节中的滑膜巨噬细胞能够表达Itgb1、Rps3和Ywhaz。研究者还通过免疫荧光染色法比较了滑膜组织中M1和M2两个巨噬细胞亚型在高峰期和消退期的分布。结果，表达CD68的滑膜巨噬细胞在两个时期均普遍存在，但是与高峰期相比，表达Arg1的M2细胞在消退期更频繁地与表达CD68的滑膜巨噬细胞出现共定位，这证实了M2巨噬细胞与关节炎消退相关。接下来，研究者检查了三种调节因子是否在M1和M2巨噬细胞之间差异表达，其与体外的M0巨噬细胞有所区别。通过qRT-PCR和Western印迹法检测发现，M2巨噬细胞中Itgb1、Rps3和Ywhaz的mRNA和蛋白质水平均显著高出M0或M1巨噬细胞中的水平（p <0.05）（图4B和4C）。此外，尽管M0和M1巨噬细胞在蛋白质水平上的差异表达模式不那么明显，但在M1巨噬细胞中它们的mRNA水平显著低于M1巨噬细胞中的水平（p <0.01）（图4B）。总体而言，这些数据表明三个潜在的调节因子（Itgb1、Rps3和Ywhaz）优先在抗炎性M2巨噬细胞中表达，而不在促炎性M1巨噬细胞中表达，因此M2巨噬细胞可能有助于CIA的消退。
图4.巨噬细胞中三个关键调节因子的表达。（A）CD68与三个关键调节因子的共定位。小鼠滑膜组织在消退期使用抗CD68的Abs与Itgb1（左）、Rps3（中）和Ywhaz（右）（比例尺：10μm）进行免疫荧光双重染色。数据是至少三次结果相似独立实验的代表。（B和C）使用qRT-PCR和Western印迹法分别测定未分化的巨噬细胞（M0）和分化的M1和M2巨噬细胞中三种调节因子的mRNA（B）和蛋白质（C）表达水平。目标基因和蛋白表达水平分别使用Gapdh和β-肌动蛋白进行标准化。数据表示为平均值±SEM（n=4~7）。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001通过事后检验（Tukey校正）的单因素方差分析确定。
Itgb1、Rps3和Ywhaz对促炎性细胞因子产生的调节
根据研究者的发现，Itgb1、Rps3和Ywhaz主要在免疫抑制性细胞（包括Treg和M2巨噬细胞）中表达，研究者接下来通过使用类风湿性关节炎（RA）的效应细胞（包括巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞（FLS））进行体外的功能性测试来验证Itgb1、Rps3和Ywhaz的抗炎活性。在LPS激活的小鼠脾细胞中，重组的Itgb1、Rps3和Ywhaz可以剂量依赖性地抑制了Il6和/或Tnf（代表性的促炎性细胞因子）的产生（图5A）。在培养的腹膜巨噬细胞中，重组的Itgb1、Rps3和Ywhaz也能够剂量依赖性地抑制LPS诱导的Il6和Tnf mRNA和/或蛋白质表达的增加（图5B和5C）。相比之下，重组的Itgb1、Rps3和Ywhaz会在LPS激活的腹膜巨噬细胞中促进抗炎性Il10的mRNA和蛋白质表达（图5D）。研究者还证实这些重组蛋白的添加不会显著影响细胞的增殖。与重组Ywhaz对巨噬细胞的作用相反，它对抗CD3/28 Abs激活的CD4+ T细胞中Ifng、Il2、Il4、Il10和Il17的产生没有直接影响。
图5.三种调节因子对抗炎性响应的促进。（A~C）Itgb1、Rps3或Ywhaz降低Il6和Tnf的mRNA和蛋白表达水平。在10 ng/ml LPS存在或不存在的情况下小鼠脾细胞（A）和腹膜巨噬细胞（B和C）与多种浓度（0、10、50或100 ng/ml）的重组Itgb1、Rps3或Ywhaz培养6小时（对于腹膜巨噬细胞）或24小时（对于脾细胞）。通过ELISA检测培养的上清液中Il6和Tnf的蛋白浓度，并通过qRT-PCR确定细胞中它们的mRNA水平。（D）三种调节因子增加Il10的表达。（E）通过敲除Itgb1、Rps3或Ywhaz的转录本来增加Il6和Tnf的表达。腹膜巨噬细胞使用Itgb1、Rps3或Ywhaz的siRNA转染24小时。（F）使用抗Rps3或抗Ywhaz抗体促进Il6和Tnf的产生。（G）使用重组的Itgb1、Rps3或Ywhaz处理6小时后，小鼠成纤维样滑膜细胞（FLSs）中Il6表达的降低。（H）使用Itgb1、Rps3或Ywhaz siRNA转染的FLSs中Il6和Il8的mRNA水平增加。对于qRT-PCR分析（C~H），首先通过Gapdh标准化目标基因的mRNA水平，然后通过仅用LPS处理（C，D和G）、未处理（F）或对照siRNA转染（E和H）的细胞内mRNA的平均表达水平进一步标准化。数据表示为两次以上（F）或三次独立实验（A~E，G和H）的平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001通过事后检验（Dunnett’s校正；A~D，F和G）的单因素方差分析或Student’ t检验（E和H）确定。
接下来，研究者测试了Itgb1、Rps3和Ywhaz的阻断剂（与其重组蛋白的添加相反）是否增加了促炎性细胞因子的产生。正如预期的那样，与对照siRNA处理的腹膜巨噬细胞相比，使用siRNA敲除Itgb1、Rps3和Ywhaz的转录本可提高腹膜巨噬细胞中Il6和Tnf的mRNA表达水平（图5E）。此外，抗Rps3或抗Ywhaz抗体的处理导致腹膜巨噬细胞中II6和Tnf的产生增加（图5F），表明内源性Rps3和Ywhaz的减少促进了促炎性细胞因子的产生。
FLS是RA中代表性的效应细胞，其作为侵入性血管翳的主要元件在关节破坏中积极参与。因此，研究者试图检测Itgb1、Rps3和Ywhaz在这些细胞中是否也显示出抗炎活性。结果，重组的Itgb1、Rps3和Ywhaz剂量依赖性地抑制了LPS激活的小鼠FLS中Il6的mRNA和蛋白质表达（图5G）；而FLS的增殖没有明显改变。反之，与腹膜巨噬细胞中的情况一样，Itgb1、Rps3和Ywhaz基因的敲除促进了FLSs中Il6和Il8的表达（图5H），这表明Itgb1、Rps3和Ywhaz的抗炎性功能不仅限于巨噬细胞，在FLSs中也很明显。
综上所述，这些结果表明Itgb1、Rps3和Ywhaz在RA激活的效应细胞（包括巨噬细胞和FLSs）内可通过抑制促炎细胞因子的产生和/或促进抗炎性细胞因子的产生而具有抗炎活性。
Ywhaz作为关节炎消退的潜在诊断目标
研究者的最终目标是确定Itgb1，Rps3和Ywhaz是否可以分别作为预测关节炎消退和抑制关节炎进展的诊断和治疗靶标。由于以可分泌性为标准从关键候选者中选择了Itgb1、Rps3和Ywhaz，因此研究者假设这三种调节因子可以在体液（如血清和尿液）中分泌并被检测到，这反映了关节炎的消退状态。为了检验这种假设，研究者检查了Itgb1、Rps3和Ywhaz的血清水平在CIA的高峰期和消退期之间是否存在差异。尽管Itgb1和Rps3的血清水平没有差异，但Ywhaz的血清水平在消退期有所增加（图6A），表明它可能是慢性关节炎消退的替代标志物。这些结果，再加上分离期的滑膜中Ywhaz表达升高以及免疫抑制性Treg和M2巨噬细胞中的发现，促使研究者调查YWHAZ是否可以反映人体系统中的消退状态。为此，研究者首先根据具有红细胞沉降率的疾病活动评分28（DAS28-ESR）将RA患者（n = 65）分为三组（低/中/高活动度）。然后，研究者比较了三组患者中血清和尿液样品内YWHAZ的丰度。在治疗之前三组患者之间YWHAZ的水平没有显著差异。然而，在抗风湿药物治疗后的四到六个月内进行连续检测时（n = 60），良好响应组（n = 23）中尿液的ΔYWHAZ水平（治疗后-治疗前YWHAZ水平）显著增加，中度响应组（n = 12）中的水平则无变化，无响应组（n = 25）中的ΔYWHAZ水平降低（图6B）。但是，这种变化在血清中不明显。基于甲氨蝶呤、羟氯喹、来氟米特、他克莫司和生物制剂（包括TNF-α阻断剂）等药物的使用情况，YWHAZ的水平并无差异。总而言之，这些数据表明YWHAZ代表了人体系统中慢性炎症的消退，其尿液中的Δ变化可能被用来反映RA消退状态的替代标志。
图6. YWHAZ是一种分泌标记物，反映了小鼠CIA和人类RA的消退状态。（A）通过ELISA分析检测高峰期和消退期的小鼠血清中Ywhaz的蛋白水平。数据表示为平均值±SEM（高峰期：n=16；消退期：n=29）。*p<0.05通过Student’ t检验确定。（B）抗风湿药物治疗前和治疗后的4~6个月内良好响应组（n=23）、中度响应组（n = 12）和无响应组（n = 25）（按照EULAR响应标准进行分类）中YWHAZ蛋白水平的比较。EULAR响应标准立足于DAS28-ESR达到的水平和变化。数据表示为平均值±SEM。*p <0.05通过Mann-Whitney U检验确定。
Ywhaz的过表达抑制了CIA
在这三种调节因子中，Ywhaz最好地反映了小鼠和人体系统中慢性炎症的缓解状态，这表明Ywhaz可以作为一种有效治疗RA的靶标。因此，研究者试图调查Ywhaz的过表达是否能改善促炎性反应和体内关节炎的进展。为此，研究者检测了通过腺病毒介导的带有GFP标签的Ywhaz基因（Ad-Ywhaz）转移对CIA小鼠中促炎性细胞因子的产生和关节炎进展的影响（图7A）。正如预期的那样，与对照腺病毒空载体（Ad-Con）的转移相比，带有GFP-标签的Ad-Ywhaz在关节中就地转移会在注射后三天（第33天）内增加小鼠滑膜组织中Ywhaz的mRNA和蛋白质水平（图7B和7C）。研究者通过荧光成像和qRT-PCR确定在关节腔内注射带GFP-标签的Ad-Ywhaz的1天、2天和3天后（初次免疫后第31、32和33天）（图7D和7E），关节中GFP荧光和mRNA表达水平分别也远高于肺和肝中的情况；实际上，GFP在肝和肺中的表达可忽略不计。相比之下，作为一个对照实验，静脉注射Ad-Ywhaz后，肝脏和/或肺部的GFP水平明显高于关节中的水平。这些数据总的表明，大量的Ad-Ywhaz-GFP特异地累积在注射的关节内，从而排除了在关节注射过程中可能溢流或溢出的情况。
图7. CIA小鼠关节内注射GFP-标记的Ad-Ywhaz后，Ywhaz和GFP的表达。（A）示意图阐明了小鼠中CIA的确立和腺病毒载体的处理。在第0天和第14天的初次免疫和二次免疫后，使用10μl 含有1×108个噬菌斑形成单位（PFU）的Ywhaz腺病毒载体（Ad-Ywhaz）或对照腺病毒载体（Ad-Con）的HEPES分别在第30天和第37天注射到小鼠的踝关节中。小鼠在第33天或52天的时候进行进一步的免疫病理学分析。（B和C）在初次免疫后通过qRT-PCR和Western印迹法分别检测CIA小鼠的滑膜组织中Ywhaz、Il6和Tnf的mRNA表达水平（B）和Ywhaz的蛋白质表达水平（C）。目标基因的mRNA和蛋白质水平分别通过Gapdh和β-肌动蛋白的水平进行标准化。（D和E）在小鼠关节内注射GFP-标记的Ad-Ywhaz或未注射的24h、48h和72h时，对CIA小鼠的肺、肝和踝关节进行GFP成像（D）以及GFP的qRT-PCR分析（E）。图（D）中的色条代表辐射率的梯度。数据在图（D）中表示为两个结果相似独立实验的代表，在图（B）（C）（E）中表示为至少3只小鼠数据的平均值±SEM。对于qRT-PCR分析，每个时间点的GFP水平首先通过Gapdh的水平进行标准化，然后通过关节腔内注射GFP标记的Ad-Ywhaz后在肺中测得的平均mRNA表达水平进行进一步的标准化。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001通过Student’ t检验（B和C）或事后检验（Dunn’s校正；E）的Kruskal-Wallis检验确定。
关节内注射GFP-标记的Ad-Ywhaz的抗炎性作用是通过显著下调33天时小鼠滑膜组织中Tnf 的mRNA表达水平来揭示的（p <0.01），其与Ywhaz 的mRNA表达水平上调形成对比（图7B）。此外，在相同的实验条件下，关节内注射Ad-Ywhaz抑制了LPS或抗CD3+抗CD28抗体激活的淋巴结细胞和脾细胞中的Il6、Tnf和/或Il17的蛋白表达水平，这证实了Ywhaz抑制体内促炎性细胞因子的产生。
最后，研究者调查了Ywhaz过表达的治疗效果。在首次II型胶原免疫后的第30天和第37天进行了两次关节腔内注射（图7A），与Ad-Con相比，Ad-Ywhaz显著抑制了CIA的进展（图8A）。在第52天的组织学分析中，研究者还观察到Ad-Ywhaz小鼠的关节中滑膜炎症和关节破坏显著减少了（图8B）。此外，Ywhaz的过表达显著抑制了关节组织中Il6和Tnf的水平，以及抗II型胶原抗体（抗CII Ab）的血清水平（p <0.05）（图8C和8D）。在相同条件下，通过Ad-Ywhaz的转移可减轻LPS或抗CD3+抗CD28抗体激活的淋巴结细胞和脾细胞中Il6、Tnf和/或Il17的产生（图8E和8F）。由于Ywhaz是一种分泌蛋白，因此Ad-Ywhaz可能具有系统性作用。总之，这些数据表明，Ywhaz的过表达具有局部和潜在的系统性作用，并可能通过下调体内促炎性细胞因子的产生来改善CIA。
图8. Ad-Yhhaz对小鼠CIA的抑制作用。（A）在首次II型胶原免疫后直至52天中，每隔两天或三天检查一次关节炎的严重程度。箭头表示在第30天和37天关节内注射1×108 PFU的Ad-Ywhaz或Ad-Con（每组和每个时间点中n=8）。数据表示为两次结果相似独立实验的代表。（B）在第52天观察到Ad-Ywhaz抑制足部的肿胀（上图）和踝关节的慢性炎症（下图）。右图还显示了基于H&E染色的炎性细胞浸润（IF）、滑膜增生（SH）和骨组织破坏（BD）来评估平均组织学的严重程度（比例尺：200μm）。（C）小鼠内注射Ad-Ywhaz降低了血清中针对II型胶原的IgG抗体（抗-CII Ab）水平。数据表示为平均值±SD。（D）CIA小鼠使用Ad-Ywhaz或Ad-Con处理52天后，其滑膜组织中Ywhaz和促炎性细胞因子（Il6和Tnf）的mRNA表达水平（每组中n=6）。目标基因的表达水平通过Gapdh的水平（作为内参）进行标准化。（E和F）Ad-Ywhaz降低促炎性细胞因子的表达。在52天时，淋巴结细胞和脾细胞从Ad-Ywhazde 或Ad-Con处理的小鼠中分离出来，接着在指定时间使用10 ng/ml LPS（E）或1μg/ml的抗CD3+抗CD28 Abs（F）刺激它们。如D2表示第2天。通过ELISA测量培养上清液中Il6、Tnf和Il17的水平。数据表示为平均值±SEM（A、B和D~F）。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001通过Student’ t检验确定。
总之，这些结果证实了Ywhaz作为核心分子在描述消退动态变化的相关网络中具有抗炎活性，表明其在慢性关节炎中具有治疗潜力。
讨论
新的促消退因子的鉴定不仅对于检测炎症性关节炎的消退状态至关重要，而且对于理解消退过程的根本也很重要。通过分析CIA进展过程中滑膜组织的动态基因表达谱，研究者确定了CIA消退的三个关键调节因子（Itgb1、Rps3和Ywhaz）。其中基于以下实验观察，研究者证明了Ywhaz对关节炎的诊断和治疗意义，即：（a）CIA消退过程中滑膜组织内Ywhaz的表达增加；（b）其主要在T细胞和巨噬细胞（尤其是Treg细胞和M2巨噬细胞）中表达；（c）在培养的脾细胞、巨噬细胞和滑膜成纤维细胞中，过量和不足的Ywhaz分别激活抗炎性反应和促炎性反应；（d）在CIA消退期的血清内以及在具有良好治疗反应的RA患者尿液内，三种调节因子中Ywhaz的表达升高；（e）关节周围注射Ad-Ywhaz可改善CIA。总的来说，通过对滑膜组织进行一个全转录组分析，研究者发现了先前未知的与炎症性关节炎消退相关的调节因子。
在这项研究中，作为炎症消退的关键调控因子候选者，研究者基于描述2836个DEGs之间相互作用的消退相关的网络分析模型，在这些DEGs中鉴定出85个核心分子。这85个分子中有37个在消退期上调，这些分子可以像那三个关键调控因子一样充当CIA消退的潜在调控因子。为了掌握这37个上调核心基因的功能特征，研究者对这些基因进行了GOBP富集，发现它们主要与细胞增殖、细胞迁移、蛋白质稳态、氧化应激反应、细胞内信号转导（特别是对cAMP和TGFβ信号转导的响应）相关。先前许多报道已证明了这些过程与炎症消退相关。例如，TGFβ信号转导、T细胞增殖和中性粒细胞的凋亡均已显示与炎症消退相关。此外，这三个关键调节因子参与细胞的粘附和迁移（Itgb1）、翻译（Rps3）和细胞内的信号传导（Ywhaz）。综合以前的报道，研究者的数据表明上调的37个核心分子可能充当潜在促消退因子的综合资源。
为了发现可用于预测或诱导RA活性消退的可溶性因子这一最终目标，研究者通过实验测试了三种分泌型调节因子（Itgb1、Rps3和Ywhaz）的功能。尽管尚未完全理解这三种分泌调节因子的抗炎作用，但先前的一些研究表明这三种调节因子与慢性炎症的抑制存在潜在联系。例如，在RA患者FLSs的细胞质膜上表达的Itgb1通过诱导Fas介导的细胞凋亡来抑制细胞的增生。Rps3在几种癌细胞系中以一种同源二聚体的形式分泌，并且其转导进入皮肤细胞中可通过抑制小鼠中的NFκB和MAPK的活性来改善耳部水肿。YWHAZ也可以由单核细胞和巨噬细胞分泌，其敲低会增加鳞癌细胞中炎性细胞因子的产生。此外，在腹膜炎、葡萄膜炎和干燥综合征的动物模型中，一种源自Ywhaz的分泌肽（PEPITEM）抑制CD3+ T细胞的跨内皮细胞迁移。与以前的发现相比，本研究的结果通过证实Itgb1、Rps3和Ywhaz的细胞来源和免疫学靶点，以及Ywhaz活性的体内调节，从而为这三种调节因子的抗炎作用提供了一个更全面的理解。
RA治疗中新出现的问题和挑战之一是在体液中鉴定出新的替代标记以预测疾病的状态。先前已经使用过的促炎性标志物（包括ESR和CRP）的减低有时并不能准确地反映RA活性，尤其是在具有抗-Il6受体抗体的患者中。此外，还没有试验能够证明促消退分子或抗炎分子在临床环境中具有预后判断价值。在这里，作者的概念验证性研究表明，Ywhaz的血清水平在CIA消退期间升高（图6A），治疗后良好响应组中YWHAZ的尿液水平与治疗前相比显著升高，而无响应组的水平则降低（图6B）；尽管尿液比其它体液更加稳定，但尚不清楚为何尿液中Ywhaz水平的这种变化很明显，而血清中却没有这种现象。考虑到Ywhaz主要由Treg细胞和M2巨噬细胞产生（图3和4），Ywhaz水平的增加可能反映出这种抑制性细胞类型的比例性扩展与慢性关节炎的改善成正比。研究者猜测尿液中YWHAZ的变化可以与先前已知的生物标志物一起作为替代标志物，以提供一个预测RA消退状态的独特窗口。但需要进一步的大规模研究来阐明这个问题。
Tnf或Il6的阻断剂已被有效地用作RA的治疗药物。但是，这些药物会增加患者对传染病的易感性，且在戒断治疗后恢复免疫耐受的可能性较小。此外，抗炎性细胞因子（如Il4、I10和I13）已被建议作为潜在的治疗候选物，但它们在临床环境中未能应用于RA的治疗。因此，除了目前使用的抑制促炎性反应的药物外，目前对于鉴定出增强抗炎性反应和促消退反应的新候选物需求尚未得到满足。研究者的发现提供了证据，即Itgb1、Rps3和Ywhaz通过阻止促炎性细胞因子和趋化因子（包括Il6、Tnf和Il8）的产生而抑制巨噬细胞和滑膜成纤维细胞的效应功能。Ywhaz对促炎性细胞因子的调节似乎不依赖于PEPITEM的肽序列，因为与Ywhaz的整个蛋白不同，PEPITEM无法抑制脾细胞和FLSs中的Il6产生。此外，Ywhaz基因在关节内的过表达大大降低了CIA的发展，而腹膜内或关节内注射PEPITEM（每次100μg，每周两次，连续3周）则没有作用。总的来说，本研究的数据表明这三种调节因子（特别是Ywhaz）可以单独或与抗炎性药物联合使用来治疗RA，从而希望实现体内的稳态修复并促进消炎。
促消退的脂质介体（包括脂氧素、消散素和保护素）已显示出抑制炎性细胞功能的作用。它们在M2巨噬细胞中合成并被释放，然后在炎症消退期间的多种细胞类型中以多种水平发挥其保护活性。这些促消退的脂质介体还促进了抑制性免疫细胞的功能，增加了Treg细胞的产生和/或使巨噬细胞极化为一种促消退的表型。与促消退的脂质介体相似，Itgb1、Rps3和Ywhaz在Treg细胞和M2巨噬细胞中高表达，并直接作用于RA的多种效应细胞（比如脾细胞、巨噬细胞和滑膜成纤维细胞）（图5），从而抑制促炎性反应和/或促进消炎反应。这些数据表明，Itgb1、Rps3和Ywhaz可能与促消退的脂质介体结合，作为RA消退的治疗或诊断分子标志。但仍需要进一步的大规模临床研究来阐明这个问题。
总而言之，研究者对于消退动力学的系统方法揭示了先前未鉴定的促消退核心调节因子（Itgb1，Rps3和Ywhaz），它们从抑制性免疫细胞中分泌并靶向广泛的RA效应细胞，因此可作为关节炎消退的治疗或诊断分子。此外，研究者的数据还提供了潜在调节因子的综合资源，其在炎症消退中的作用可以通过实验检测。该资源对于那些研究分子特征和机制从而治疗慢性炎症疾病（包括RA）的研究人员可能有用。研究者认为该方法也可以应用于其它自身免疫性疾病，从而找到新的与消退相关的分子和信号通路。
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