科研 | 麻省理工学院：不同器官中异种移植乳腺癌转移的ECM蛋白质组分析显示了不同的转移龛
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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大多数癌症相关的死亡都是由转移引起的，而转移性癌症有一个鲜为人知的方面是，原发肿瘤的细胞能够适应并创造新的小生境，并在多个不同的继发部位存活。我们使用定量质谱分析转移至大脑、肺、肝和骨髓的细胞外基质(ECM)，它是转移灶的关键成分，均来自于亲本MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞。在转移灶中，肿瘤细胞和基质细胞共同形成小生境；基质细胞主要产生核心的、结构性的ECM蛋白，而肿瘤细胞产生多种ECM相关蛋白，包括分泌因子和基质的调节因子。此外，肿瘤和基质细胞共同在每个组织中创造了不同的小生境，SERPINB1蛋白在脑转移中升高，如果使其下调可导致脑转移减少，表明一些特定于细胞壁龛的ECM蛋白可能参与了转移趋向性。
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实验设计
实验结果
1. 定量蛋白质组学强调了组织间转移的差异性
为了评估三阴性乳腺癌细胞在不同组织中生长时所形成转移的ECM组成，我们以转移性MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞系为模型，将这些细胞引入NOD-SCID小鼠循环系统，以便在大脑、肺、肝和骨髓肿瘤中定居。我们从NOD-SCID小鼠身上提取脑、肺和骨转移瘤，发现这些细胞在NOD-SCID小鼠中不会形成肝脏肿瘤，这可能是由于NK细胞水平较高，因此我们也将这些细胞注射到NOD-SCID- il2r小鼠体内以收集肝转移灶。为了进行比较，我们收集了两种小鼠的骨肿瘤。
我们收集四种组织的转移性和正常组织样本并按照方法中所述进行浓缩后，如前面所述，对样本进行ECM蛋白含量富集。然后进行western blots后，追踪ECM蛋白的富集和细胞内蛋白的缺失，样品酶解后用串联质谱(tandem mass tags, TMT)进行定量质谱分析。样本根据其来源组织、小鼠品系、正常或转移样本类型命名(图1B，图表S1)。不同组织的初步无标记分析显示ECM蛋白谱有明显差异(图S2和图S3)。与其他基质含量相对较高的组织相比，大脑的ECM蛋白总体数量要低得多，而肝转移的组织中糖蛋白的比例则明显高于其他转移的组织。
基质组分为基质组蛋白(胶原蛋白、ECM糖蛋白、蛋白聚糖)和基质相关蛋白([1]ECM调节剂，如蛋白酶和交联酶；[2]与ECM相关的蛋白，通常与核心基质组蛋白和[3]分泌因子，如生长因子等相关)。在所有样本中，我们量化307个人和小鼠的母组蛋白，包括近100个糖蛋白和超过70个ECM调节因子(图2A)。我们将样本分为两个10-plex TMT系列(图表S2)，但我们观察到两个TMT plex之间有80 - 90%的重叠(图2B)，大部分非重叠的蛋白来自Plex A，包括所有正常组织样本。因此，Plex A中30/42的非重叠蛋白(补充图S4A)来自基质(小鼠蛋白)，而在Plex B中只有8/18的非重叠蛋白(图S4B)，这提示许多蛋白只存在于正常组织中的Plex A间质蛋白。此外，在我们的数据中母体细胞蛋白仅占定量蛋白总数的5%左右(图2C)，但由于我们的ECM富集，它们代表了总蛋白丰度的三分之一(图2D)，尽管像大脑这样的组织中基质含量极低(图S3)。最后，对每对样本之间的Spearman相关性的计算显示，转移性样本倾向于按组织聚集，但个体组织，尤其是大脑，彼此之间存在显著差异(图2E)。与相应的正常组织相比，一些转移组织截然不同，例如肝脏，它们没有形成一个组织特异性的分支。因此，即使在全球范围内，相同的肿瘤细胞群也可以在不同的器官中产生明显不同的转移龛。
图2 定量质谱数据概述
(A)在属于每个母体细胞类别的所有样本中量化的蛋白质数量。(B)两个TMT复合体中每个复合体中被量化的蛋白质数基质组和非基质组蛋白质量。(C)所有样本中的定量数。(D)在所有样品中定量的基质组和非基质组蛋白质总强度。(E)样本的斯皮尔曼等级相关系数(rho)矩阵，使用所有量化的蛋白质计算。
2. 肿瘤和基质细胞产生不同成分的转移生态位ECM
在异种移植模型系统中，人肿瘤细胞生长嵌入小鼠基质组织中。我们利用这种物种差异，根据同一蛋白质在人类和小鼠版本的肽序列差异，来区分一个给定的蛋白质是来自肿瘤还是来自基质细胞。在这项研究中，我们使用术语“肿瘤细胞”来表示所有人类癌细胞，我们使用术语“基质细胞”来表示肿瘤中所有非癌症的小鼠细胞。肿瘤细胞源性蛋白质和基质细胞源性蛋白质的区别在跨多个组织的转移小生境中尤其有用，因为肿瘤细胞生长在明显不同的基质环境中。转移瘤的基质体蛋白主要由基质产生(图3A)。此外，肿瘤和基质产生不同类型的基质体蛋白，肿瘤主要产生基质体相关蛋白，如ECM调节因子和分泌因子，基质主要产生核心基质体蛋白，特别是胶原蛋白(图3B)。
通过检验一个给定的蛋白质是否仅由肿瘤细胞、仅由间质细胞或肿瘤和间质室共同产生，可以进一步分解基质体蛋白的肿瘤和间质产生(图3C, D)。肿瘤细胞制造的蛋白中最大的成分是分泌因子，其次是ECM调节因子(图3E)，表明肿瘤细胞分泌因子调节现有的组织ECM，形成转移生态位。事实上，肿瘤细胞产生的总丰度是基质细胞的两倍多，尽管基质细胞产生的基质体蛋白质总量要大得多(图3A, D)。此外，进一步观察仅由肿瘤细胞产生的40种被量化的人类蛋白，可以发现主要是基质组相关蛋白的混合，尤其是S100家族、LOX家族和SERPINB1家族的几个成员(图S5)。与此同时，独特的基质来源蛋白主要由ECM糖蛋白组成，肿瘤和基质都负责产生胶原蛋白(图3E)，而胶原蛋白主要是纤颤(图3F)。总体而言，脑转移瘤的基质组蛋白丰度至少低四倍(图3G)，但其生态位的多样性也显著提高，基质组相关蛋白的比例更高，特别是与肺和骨相比(肺和骨由至少80%的胶原组成)(图3H)。大脑中整体多样性的增加主要是由相对较低的基质对其生态位的贡献驱动的(图S6A, B)，因为大脑中基质组蛋白的总丰度和相对丰度与其他组织比较相似(图S6C, D)。值得注意的是，骨转移与其他组织相比，肿瘤细胞源性母体细胞蛋白的贡献也高出两倍以上(图S6C)。因此，肿瘤和基质细胞在创造转移瘤微环境的基质中扮演着不同的角色，基质细胞产生更多的核心结构蛋白，而肿瘤细胞则是基质环境的调节剂。
图3 肿瘤细胞和基质来源的基质组蛋白的产生
所有显示的丰度是通过增加转移样本中蛋白质的分级强度计算出来的，按基质组分类进行分解。(A)肿瘤细胞来源的(人)和基质来源的(小鼠)基质体蛋白质的总和相对丰度的定量。(C)仅由肿瘤细胞(红色，左)、基质细胞(绿色，右)或由两个细胞间室(中间，黄色)产生的转移中的蛋白质数量。(D)总和(E)仅由肿瘤细胞、仅由基质细胞或由两种细胞间室产生的母粒蛋白质的相对丰度。(F)肿瘤和转移中基质细胞产生的胶原类型的总强度:基底膜、中断的三螺旋纤维相关胶原(FACIT)，以及其他。(G)每个组织中每个转移样本的母粒蛋白总丰度。(H)在转移到每个组织的所有转移中，基质组蛋白种类的相对丰度。
3. 肿瘤和间质在每个组织中产生明显的转移小生境
除了肿瘤和基质蛋白类型的广泛差异外，定量质谱还可以识别表征每个组织转移生态位的特定蛋白。我们进行了标记选择分析，将每个特定组织的转移样本与所有其他转移样本进行比较，寻找仅在该组织中显著升高的蛋白质。这些比较并不是简单地鉴别出每个组织中含量最高的蛋白质，而是在一个组织中与其他组织相比，在丰度上最显著不同的蛋白质。分别对肿瘤细胞来源(人)和基质来源(小鼠)蛋白进行了分析。
从肿瘤细胞来源蛋白开始(图4A)，大脑具有一组特别大且多样化的特征蛋白，包括一些仅由肿瘤细胞产生的蛋白：CD109、SERPINB1、HCFC1和cerebellin-1(CBLN1)(图S5)。肺转移的特征是几个基底膜蛋白，包括胶原COL4A4和laminin-121(α1β2γ1，原名laminin-3)。除了COL6A5之外，肝脏并没有被肿瘤细胞来源的蛋白所分隔，但是骨髓转移龛显著增加了S100A6和S100A11的水平，这两种蛋白都是仅由肿瘤细胞产生的(图S5)。我们还将转移样本总数与所有正常组织进行了比较，以确定在所有组织中MDA-MB-231细胞转移中广泛存在的蛋白(图4B)。总体上最丰富的蛋白是S100A4。值得注意的是，还有一些膜联蛋白家族成员(ANXA1和ANXA2)、蛋白多糖perlecan (HSPG2，在基底膜和其他基质中都发现)和蛋白酶如组织蛋白酶D (CTSD)。由于没有引入人类MDA-MB-231细胞，这些小鼠组织中就不会出现人类蛋白，因此每个转移龛的所有这些肿瘤细胞衍生蛋白特征都代表了肿瘤细胞对每个组织的特殊适应。
接下来，我们对每个组织中最显著升高的肿瘤细胞来源的ECM蛋白使用独创性通路分析(IPA)来预测可能的共同上游调节因子(图4C)。TGFβ1被预测为所有组织的调节因子，而C-C趋化因子受体2 (CCR2)被预测为四个器官中的三个(脑、肺、肝)。然而，大多数预测的上游调控因子对每个组织都是独一无二的，与观察到的不同ECM生态位相一致。也就是说，不同的ECM环境似乎是不同的管理程序的结果。因此，MDA-MB-231肿瘤细胞具有在不同组织环境中分泌的一套共同的基质组蛋白，以及对每个位点的独特适应性，这包括在特定蛋白和预测调控程序方面。
一项平行比较发现了特定于每个转移龛的基质来源蛋白(图5A)。大脑再次显示出各种各样的小生境蛋白质，其中许多已知在大脑中特异性表达，如分泌的神经糖蛋白Lgi1及其受体Adam22，以及短小蛋白聚糖(Bcan)。肺间质很像肿瘤细胞来源的肺基质，由许多基底膜蛋白区分，包括6种不同的层粘连蛋白链和5种IV型胶原，但它也含有肺特异性蛋白，如肺表面蛋白相关蛋白A1 (Sftpa1)。肝基质中含有已知的转移启动子Tnc和Fn1，以及一些与凝血反应相关的典型蛋白:纤维蛋白原(Fga、Fgb和Fgg)、凝血酶(F2)和血管性血斑因子(Vwf)。此外，骨龛中血小板反应蛋白-1 (Thbs1)、另一种S100蛋白(S100a13)、蛋白酶cathespin-G (Ctsg)、蛋白酶抑制剂cystatin C (Cst3)和steff -2 (Stfa2)的水平显著升高。
考虑到这些基质蛋白在每个转移组织中是最丰富的，它们中的许多可能只是代表正常组织ecm之间的差异。因此，通过从每个转移性样本的值中减去每个蛋白的正常丰度，可以进行类似的标记选择(图S7A - D)。这种方法在每个组织中发现了较少的基质蛋白显著升高，但每次分析发现的许多顶级蛋白是相似的。
接下来，我们进行了基质来源蛋白的标记选择，这些蛋白在正常组织中比在转移性组织中广泛升高(图5B)，这在原则上可能代表潜在的转移抑制因子。事实上，在这些名单中有小管间质性肾炎抗原样1 (Tinagl1)，最近在一些小鼠模型中显示它能抑制TNBC的进展和转移，并与人类患者样本的生存相关。最后，我们使用IPA来预测转移到每个组织的基质来源ECM蛋白的上游调节因子(图5C)。虽然该分析确定了组织间一些常见的调节因子，如TGFβ1和Ccr2，但对每个组织而言，基质来源的ECM蛋白的预测调控因子要比肿瘤细胞来源的蛋白明显得多(图4C)。这些数据与这一事实相一致，即每个组织的转移都源于相同的肿瘤细胞群，但可能包含不同的基质细胞类型。在肿瘤和基质的产生中，转移小生境在组织与组织之间的基质组组成上显示出相当大的多样性，这表明肿瘤细胞在每个组织中不容易再现相同的ECM环境，而是对每个组织诱导了特有的适应。
图4 肿瘤细胞来源蛋白在不同的转移部位特异性升高
(A)比较不同转移部位的肿瘤细胞来源蛋白(标记物选择，见方法)。图中显示的是相对于其他转移性组织，每个转移性组织(左侧)中所有的蛋白质显著升高。(B)与正常组织相比，所有转移性样本中肿瘤细胞来源蛋白的比较显著升高(右侧)。两种热图中显示的所有蛋白质在对照组之间都有显著差异(信噪比，P <0.05和FDR<0.1)。(C)每个组织的独创性通路分析(IPA)预测的肿瘤细胞来源蛋白的潜在上游调控因子图，并在重叠区域预测多个组织的调控因子。
图5 在转移中特异性改变的基质来源蛋白
(A)不同转移部位间基质来源蛋白的比较(标记物选择，见方法)。图中显示的是相对于其他转移性组织，每个转移性组织(左侧)中所有的蛋白质显著升高。(B)与所有正常样本相比，所有转移样本间质来源蛋白的比较显著降低。两种热图中显示的所有蛋白质在对照组之间都有显著差异(信噪比，P <0.05和FDR<0.1)。(C) IPA预测的各组织间质来源蛋白的潜在上游调控因子图，并在重叠区域预测多个组织的调控因子。
4. SERPINB1敲低显示了组织特异性依赖
鉴于上述鉴别出的蛋白是各种转移细胞的特征，我们想测试它们是否会影响转移趋向性，即肿瘤细胞在特定器官上的定植和生长的差异趋势。例如，有选择地抑制脑转移瘤中产生的一种蛋白质是否能抑制脑转移瘤的发展?这是最容易实现的肿瘤细胞来源的蛋白质。我们关注的是大脑，因为它有相对丰富的独特标记和较少研究的性质的大脑生态位本身。与正常组织相比，SERPINB1在脑和肺转移灶中均升高，但总体水平在脑中最高(图6A)。我们使用CRISPRi敲除MDA-MB-231细胞SERPINB1的表达(图6B)，并通过心内注射将这些细胞导入到NOD-SCID小鼠的循环中。SERPINB1基因敲除可显著减少2倍以上的脑转移，轻微(但无统计学意义)减少肺转移，且未改变骨转移的平均负荷(图6C, D)。在NOD-SCID小鼠中未观察到肝转移。这些体内结果与我们通过质谱分析观察到的不同转移组织中的蛋白水平一致(图6A)。此外，SERPINB1的改变与多种癌症患者较低的无进展生存显著相关，这表明该蛋白可能在其他情况下参与了转移(图S8)。我们还测试了一些额外的脑转移和整体转移标志物的敲除，但是，尽管一些对转移趋向性有影响，但在研究的样本量上没有统计学意义(图S9A - D)。这可能意味着这些母组蛋白本身对趋向性的影响不够，而同时改变其中几个可能会产生更大的影响。无论如何，我们的结果表明我们关于转移细胞的数据可以用来发现对转移有组织特异性作用的母体细胞蛋白。
最后，为了检验我们在脑转移中发现的ECM蛋白的潜在临床关联，我们对来自患者原发乳腺肿瘤的表达数据进行了基因集富集分析(GSEA)，将复发于脑的肿瘤与复发于其他部位的肿瘤进行比较。我们发现，脑组织中肿瘤细胞来源和基质来源的ECM蛋白(包括SERPINB1)以及其预测的上游调控因子均在复发的原发肿瘤中显著富集(图S10A - E)。这些数据表明，我们在已确定的脑转移中观察到的一些ECM变化可能已经出现在原发性肿瘤中，并可能预测其后期转移。事实上，来自患者循环肿瘤细胞(CTCs)的数据表明，这些细胞在患者和小鼠模型中都可重复地表现出有机性行为，进一步表明一些有机性适应可能在转移之前发生。
图6 SERPINB1敲低对转移性趋向性和生长的影响
(A)在每个正常(正常)和转移(Met)组织中SERPINB1蛋白水平(相对于合并对照样本log2倍变化值)的定量质谱分析。所有的骨头样本都来自于NOD-SCID小鼠。(B)表达sgRNA的MDA-MB-231细胞对小鼠Timp1 (sgControl)或SERPINB1的SERPINB1表达的qPCR。(C)心内注射sgControl或sgSERPINB1细胞3周后大脑、肺和骨骼的代表性图像。标尺，10 mm。(D)肿瘤所占组织表面积的比例。每组n=18只小鼠。ns,不显著;* P< 0.05;双尾学生t检验。
结论
在本研究中，我们对MDA-MB-231乳腺癌异种移植物转移到脑、肺、肝和骨髓中的ECM蛋白进行了无偏向的定量质谱检测。该分析量化了307种由人类肿瘤细胞和小鼠基质细胞或两者产生的人类和小鼠基质组蛋白，并鉴定了具有特定转移龛或整体转移特征的肿瘤和基质源蛋白。最后，作为影响转移性的ECM蛋白的一个例子，我们发现肿瘤细胞SERPINB1敲低显著降低了脑肿瘤的生长。