科研| J EXP BOT：气候和发育调节枣海枣叶片的代谢组和抗氧化系统（国人佳作）
编译：王艳林，编辑：谢衣、江舜尧。
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论文ID
原名：Climate and development modulate the metabolome andantioxidative system of date palm leaves
译名：气候和发育调节枣海枣叶片的代谢组和抗氧化系统
期刊：Journal of Experimental Botany
IF：5.515
发表时间：2019. 10
通讯作者：杜保国
通讯作者单位：绵阳师范学院
实验设计
假设：本研究提出三个假设：（1）由于提高的ROS清除能力，在不同的气候下基本保持了叶片活性氧（ROS）的水平，尤其是在夏季适应的植物中，酶活性和抗氧化系统的抗氧化剂含量增加；（2）适应夏天的温度会改变脂肪酸的含量。期望找到更高浓度的饱和脂肪酸，赋予膜更大的粘度；（3）温度诱导的抗氧化剂浓度和脂肪酸谱的变化与成熟叶片相比，幼叶更明显。
实验设置及指标检测：将生长稳定的两年生海枣植株放入四个全自动气候可控的步入式生长箱中，调整生长箱的条件以适应典型的沙特阿拉伯夏季和冬季地气候条件。实验开始后9天达到最终气候条件。夏季平均正午温度在40℃左右，冬季为25℃左右。在夏季和冬季气候条件下，最大辐照度相似，即光子通量密度为600 μM m-2 s-1。每天，用40 mL去离子水浇灌植株（上午06:00）。为了获得相似的土壤水分利用率（约20％的土壤体积水含量），在夏季气候下向植株提供额外的40 mL去离子水（每天晚上18:00）。在适应不同的生长温度3周后，在中午收获六株植株（每个季节）的成熟叶片（ML）和仍在发育的幼叶（YL）。检测叶片水合作用，总碳（C），总氮（N），δ13C，δ15N标记，硫醇含量，抗坏血酸含量，谷胱甘肽还原酶（GR）活性，脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性，过氧化氢（H2O2）含量，总氨基酸，可溶性蛋白质，色素含量，结构氮含量，阴离子（NO3−，PO43−，SO42−）。通过GC-MS检测叶片代谢物。
实验结果
1 探索性分析表明气候和发育对叶代谢和抗氧化系统的影响
根据气候条件（15％由PC2解释）和叶片发育（25％由PC1解释），稀疏偏最小二乘法判别分析（sPLS-DA）清楚地表明了海枣叶片的聚类（图1）。总体而言，气候和发育对代谢产物的影响不同。也就是说，气候主要影响一些糖，多元醇和氨基酸的丰度，其中ML和YL的H2O2水平，酶活性和抗氧化剂的丰度差异很大（补充表S1）。
图1 分别基于夏季（圆形）和冬季（三角形）气候下生长的植物的成熟叶（ML，空心符号）和幼叶（YL，实心符号）中的代谢物海藻幼苗的聚类。半透明阴影表示95％的置信度区域。
2 气候影响叶片代谢和抗氧化系统
夏季和冬季气候条件对YL的生理指标有显著影响（P<0.05），与冬季气候相比，夏季H2O2含量高28％，TAA含量高31％，但总抗坏血酸含量降低23％（表1、2）。此外，在夏季气候下，YL在25℃和40℃测定温度下的DHAR活性均显著增加（图2）。观察到气候对叶片水合作用，其他抗氧化剂水平以及基础碳和氮组分的影响很小。色素含量不受气候显著影响，除了YL中的Chl a/b比在夏季气候中显著下降（表2）。在夏季气候下，叶片的硝酸盐，硫酸盐和磷酸盐含量略有增加（表2）。
与冬季气候条件相比，夏季气候导致两种叶片中棉子糖，半乳糖醇，6-蔗果三糖和古洛糖酸-1,4-内酯的丰度更高，而6-磷酸葡萄糖，木糖，山梨糖，半乳糖，乳糖，山梨醇，半乳糖酸，甘油酸，脱氢抗坏血酸（DHA）二聚体和异抗坏血酸的丰度较低（图3）。
夏季气候中，参与三羧酸（TCA）循环的主要代谢产物柠檬酸，琥珀酸，延胡索酸和苹果酸通常被上调，而YL中的琥珀酸除外。同样，在夏季气候下，氨基酸甘氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，γ-氨基丁酸（GABA），谷氨酸和谷氨酰胺的丰度增加，在冬季气候下，叶片中的赖氨酸和N-乙酰基鸟氨酸含量较高（图3）。与冬季气候相比，夏季气候还增加了N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），烟酸和磷酸的丰度。两种叶龄中，夏季气候下，3-磷酸甘油的含量都下降了（图3）。
夏季气候下，叶片中的莽草酸酯及其代谢类黄酮产物花旗松素，儿茶素和表儿茶素含量降低，影响了苯丙烷类反式芥子酸和苯甲酸水杨酸的含量普遍增加。ML和YL均在夏季气候下增加了己酸，十二烷酸，十四烷酸和5,8,11,14-二十碳四烯酸四种脂肪酸以及硬脂醇，α-生育酚和β-谷甾醇（图3）。与冬季气候条件相比，ML的脂肪酸十六烷酸，9,12-十八碳二烯酸，9,12,15-十八碳三烯酸和十七烷酸和氨基酸脯氨酸在夏季气候含量较低，而在夏季气候下，YL的这些代谢物的丰度通常会增加。在夏季比冬季气候下YL的肌醇和磷酸单甲酯的丰度明显更低，而这些化合物的水平在ML表现出相反的作用（图3）。
图2 在25℃（左半面）和40℃（右半面）下测定的冬季（灰色条）和夏季（阴影条）气候下生长的海枣幼苗的成熟和幼叶中的谷胱甘肽还原酶（GR）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的体外活性。不同的小写字母表示冬季和夏季气候之间存在显著差异（P<0.05）。在两种测定温度下，无论气候条件如何，幼叶中的酶活性均显著高于成熟叶片中的酶活性（发育：*** P<0.001）。在别在25℃（P = 0.003）和40℃（P <0.001）下测得的DHAR活性中观察到了发育与气候之间的显著相互作用。在GR活性中没有发现发育与气候之间的重大相互作用。在40℃下测得的酶活性均显著高于25℃下测得的酶活性（P <0.01）。
图3成熟和幼叶的夏季和冬季气候之间（左图），以及冬季和夏季气候的成熟和幼叶（右图）之间的低分子量代谢物的Log2转换的相对丰度。星号表示两组之间的显著差异（P<0.05），即分别在成熟叶片和幼叶的夏季和冬季之间（左图），以及分别在冬天和夏季下的成熟叶片和幼叶之间（右图）。A143018，N-甲基反式-4-羟基-L-脯氨酸（2S，4R）-4-羟基-1-甲基吡咯烷-2-羧酸；DMDP，2,5-二羟甲基-3,4-二羟基吡咯烷；A181001，Golm库中未知代谢物的代号；GABA，γ-氨基丁酸；P，磷酸盐；未发现叶龄与气候之间存在显著相互作用。
3 叶片发育影响叶代谢和抗氧化系统
与ML相比，YL的水合程度更高，H2O2含量较低（表1、2），以及更多的负δ13C值（P<0.05），与气候无关（表2）。YL中GR和DHAR的体外酶活性显著高于ML（P<0.05）（图2A）。除γ-谷氨酰半胱氨酸外，ML和YL之间的抗坏血酸和硫醇水平没有显著差异，在夏季气候下YL中γ-谷氨酰半胱氨酸含量更高（表2）。
YL中的TAA含量高于ML，尤其是在夏季条件下（P<0.05）（表2），这可能归因于许多特定氨基酸：（i）3-磷酸甘油酸衍生的丝氨酸和甘氨酸;（ii）2-酮戊二酸衍生的脯氨酸，精氨酸，N-乙酰-谷氨酸，焦谷氨酸，N-乙酰-鸟氨酸和GABA;（iii）丙酮酸衍生的丙氨酸和β-丙氨酸;（iv）草酰乙酸衍生的天冬氨酸和苏氨酸;（v）莽草酸酯衍生的苯丙氨酸。脯氨酸，丙氨酸，苏氨酸和N-乙酰基谷氨酸（P<0.05）尤其是造成夏季气候下YL和ML之间差异的原因（图3）。通常，在冬季气候中，除脯氨酸，丝氨酸和焦谷氨酸外，这些氨基酸的含量也较高。此外，在较凉的条件下与ML相比，色氨酸和谷氨酰胺在YL中的含量更高（图3）。在夏季或冬季气候下，叶片发育对总碳，总氮，可溶性蛋白，色素，结构N和阴离子含量，C/N和叶绿素a/b比以及δ15N特征没有明显影响（表2）。
在两种气候下，ML中大多数可溶性糖的浓度均高于YL，除了夏季气候下的木糖和6-蔗果三糖以及葡萄糖和赤藓糖（图3）。ML中的肌醇半乳糖苷，肌醇，山梨醇和糖酸半乳糖酸和甘油酸含量较低，特别是在冬季气候下。无论气候如何，YL中的莽草酸酯含量均低于ML。在ML中，脂肪酸己酸，十二烷酸和十四烷酸在夏季和冬季气候中更为丰富，而十七烷酸，十六烷酸，9,12-十八碳十二烯酸和9,12,15-十八碳三烯酸尤其在夏季气候下丰度较低。与赖氨酸相反，Neu5Ac，3-磷酸甘油，半乳糖酸-1,4-内酯，4-羟基-苯甲酸，反式咖啡酸，水杨酸，烟酸，α-生育酚和β-谷甾醇在ML中丰度较高，脲，马来酸，2R，5R-二羟甲基-3R，4R-二羟基-吡咯烷（DMDP），焦磷酸盐，光色素和未知化合物A143018在YL中的丰度较高，而与气候无关（图3）。对于这些指标，未发现叶龄与气候之间存在显著的相互作用。
讨论
1 海枣叶片的季节性气候特征
在本研究中，主要由温度差异决定的沙特阿拉伯典型两种相反的气候条件（夏季与冬季气候）显示出对海枣叶片叶面ROS含量和抗氧化系统的显著影响，这证实了编码ROS清除相关蛋白的基因在热反应中的表达增加。H2O2在植物中起着双重作用，既可以充当信号分子，介导对非生物和生物胁迫的响应，又可以在高水平积累时协调程序性细胞死亡。尽管在正常的植物代谢过程中会不断从各种来源生成H2O2，但线粒体呼吸作用和叶绿体类囊体的O2－的光和产生被认为是细胞内意外ROS产生的主要来源。Safronov等（2017）确定了海枣基因编码的ROS清除相关蛋白（例如抗坏血酸过氧化物酶，超氧化物歧化酶，脱氢抗坏血酸还原酶和硫氧还蛋白）靶向叶绿体和胞浆。这些基因表达增加，而在单独升高的温度下或与干旱结合时，编码针对线粒体的蛋白质（例如戊二醛和硫氧还蛋白）的基因的表达降低。与冬季气候相比，夏季温度分别导致ML和YL中H2O2含量分别增加37％和28％（YL P<0.05），这在一定程度上与我们的第一个假设相反。尽管在本研究中未直接测定ROS的产生，但ROS水平升高（尤其是在YL中）最可能是由于提高了生产效率所致，大概是出于信号传递的目的。推测是由于夏季气候下明显刺激的光呼吸作用，如甘氨酸和丝氨酸丰度略微升高，同时其前体甘油酸丰度降低所表明。未来研究中的代谢物通量分析将验证这一假设。由高温引起的刺激的光呼吸在本研究中似乎是可行的，因为样品是在中午40℃的峰值温度下采集的，该温度高于最近报道的海枣光合作用的最佳温度（Aopt）36℃。本研究还强调，虽然夏季Aopt有所增加，但代谢紊乱的风险也更大。
谷胱甘肽-抗坏血酸循环是H2O2清除最重要的代谢途径；其氧化还原状态和/或含量可以作为细胞内氧化应激的指标。它的构成底物抗坏血酸是植物中最丰富的水溶性氧化还原化合物，尤其是在叶子中，它可以代表10％以上的可溶性碳水化合物。植物组织中的抗坏血酸浓度是合成与分解代谢平衡的结果。最新证据表明，虽然抗坏血酸可以几种不同的方式合成，但半乳糖途径是植物体内合成的大部分抗坏血酸的来源，该途径受温度和季节适应的调节。在本研究中，尽管夏季气候中的H2O2水平增加，但夏季YL中的总抗坏血酸含量比冬季气候中低30％（P<0.05），而在夏季气候下DHAR活性的增加（图2）可能弥补了这种下降的趋势。同样在这种情况下，在未来的研究中需要进行ROS和抗氧化剂通量分析，以检验这一假设。
众所周知，氧化应激可以触发抗氧化酶的总可提取活性的增加，其最大可提取活性早已被认为是细胞氧化还原状态的指标。显然，DHAR活性的增强似乎不足以在总抗坏血酸含量降低的情况下维持夏季气候下的H2O2水平。因此，我们的第一个假设必须被推翻。相反，抗坏血酸合成减少可能是造成这种影响的原因，因为其主要代谢前体半乳糖的水平在夏季气候下也有所降低。这些结果部分与先前的研究（Arab等人，2016）一致，该研究报道了在升高的气温下，海枣幼苗中总抗坏血酸和还原性抗坏血酸含量降低，但叶面半胱氨酸，γ-谷氨酰半胱氨酸和GSH含量也降低。在本研究中，在夏季和冬季气候的植株之间，未发现GSH含量及其前体半胱氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸的含量存在明显差异。总而言之，本研究表明，海枣叶片可能除了抗坏血酸-谷胱甘肽循环外，还具有其他生理机能来适应升高的温度。
正如Arab等人（2016年）和Du等人（2014年）分别观察到的海枣叶片和花旗松针叶，目前夏季和冬季气候之间的叶面总氮和可溶性蛋白含量均无显著差异。但是，在夏季气候下，ML中含有较高的TAA含量，且在尤其冬季气候下YL中发现较高的TAA含量（表2）。YL中TAA含量的增加主要归因于焦谷氨酸和苏氨酸，以及谷氨酸家族中3磷酸甘油酸衍生的丝氨酸和甘氨酸，丙酮酸衍生的丙氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，脯氨酸和GABA以及芳香族氨基酸苯丙氨酸的少量积累的累加效应（图3）。焦谷氨酸，也称为5-氧脯氨酸，是谷氨酸合成的前体，并且是谷氨酸稳态水平的主要贡献者。焦谷氨酸的积累被认为可以增强抗氧化系统。正如其他作者所报道的，与冬季气候相比，夏季气候下的海枣叶的赖氨酸，N-乙酰-谷氨酸和N-乙酰-鸟氨酸（鸟氨酸的前体）的丰度要比冬季低，并且在本研究中的ML中伴有精氨酸的大量积累。与这些结果相反，在升高的空气温度下，当年的花旗松针叶中观察到参与TCA循环的TAA和有机酸含量降低，表明氨基酸合成对温度升高的种特异性反应。观察到的夏季气候条件下YL中氨基酸含量的增加可能至少部分是由于土壤温度升高而提高的氮素吸收以及柠檬酸和苹果酸含量增加造成的TCA循环的上调所致。
相容性溶质对于通过渗透调节维持细胞充盈以及在胁迫条件下酶的稳定至关重要。作为初级代谢的关键成分，糖对基因表达水平的热量响应，对海枣叶片中的代谢调节起着重要的信号转导作用。在当前的研究中，我们没有看到在两种叶片中气候对蔗糖或葡萄糖和果糖含量的明显影响。相反，海枣叶片在冬季比夏季积累了更多的山梨糖和木糖以及山梨糖醇（山梨糖的前体）。肌醇半乳糖苷和棉子糖被认为可以保护植物细胞免受高温，干旱，盐或寒冷造成的氧化损伤。与这个假设一致，我们在夏季气候下观察到了YL中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量增加，而肌醇半乳糖苷的前体肌醇的水平却下降了（图3）。与我们的观察结果相反，花旗松的针叶和拟南芥叶在高温下显示了肌醇半乳糖苷和棉子糖水平的降低。我们的发现支持这样的观点，即多种初级代谢产物可以共同充当相容性溶质。
相反，Arab等人（2016）报道，脂肪酸成分不受热影响，热对海枣叶片的基因表达分析揭示了热量对脂肪酸和类黄酮生物合成的强烈影响。后一种结果是可以预期的，因为脂质成分决定了叶绿体膜对热变性的敏感性。另外，响应于诸如热，冷或干旱以及生长和发育期间的环境条件的改变，需要调节膜结构的物理特性以应对胁迫条件。与Safronov等人（2017）的结果一致，气候显著影响脂肪酸的含量，降低了不饱和9,12-十八碳二烯酸（C18:2）和9,12,15-十八碳三烯酸（C18:3）和ML中饱和十六烷酸的水平，增加了夏季气候YL中的饱和十四烷酸和十七烷酸含量（图3）。因此，我们的第二种假设得到了充分的支持。同样，在干旱处理过的海枣叶片中观察到9,12-十八碳二烯酸和9,12,15-十八碳三烯酸的水平下降。同样在豌豆叶片中，冬季条件下不饱和脂肪酸含量要高于夏季。这种变化可以在更具氧化性的细胞环境下维持膜的流动性，并提高植物在较宽温度范围内生长的能力。
酚类化合物对于次生壁成分的合成至关重要，据报道，这受到温度的显著影响。对温度敏感的酚类化合物包括来自苯丙烷途径的芳族氨基酸，它们也作为植物激素，电子载体，辅酶因子和抗氧化剂的前体。在本研究中，如反式芥酸和反式咖啡酸的大量刺激所揭示的那样，在夏季条件下酚类化合物的积累受到青睐，而黄酮类化合物则在低温（冬季气候）条件下积累。在两种叶片中，于夏季相比，冬季均积累了花旗松素，儿茶素和表儿茶素以及前身莽草酸酯（图3）。同样，低温还诱导欧洲栓皮栎和拟南芥叶片中苯丙氨酸的积累并提高了苯丙氨酸解氨酶（PAL）和查尔酮合酶（CHS）的转录水平。
2 枣椰子的叶片发育性状
海枣在夏季和冬季气候下都会发育新的叶片。为了确定叶片发育差异，本研究在两种气候条件下分析了正在发育和完全发育的ML。与我们的第三个假设相一致，在夏季和冬季气候下，观察到了对叶片水合作用，δ13C特征，ROS水平和代谢产物谱的强烈发育作用。与ML相比，YL具有更强的叶片水合作用，更大的δ13C负值，H2O2降低了40％以上，而与气候条件无关，表明YL能够有效清除ROS。不论气候如何，YL中DHAR和GR的酶活性都极高（图2），以及夏季气候条件下YL脯氨酸的丰度显著提高（图3）支持了这一观点，后者被认为是海枣非生物胁迫的普遍反应。同样，在烟草幼株中发现较低的H2O2含量和较高的过氧化氢酶活性。1年生云杉针叶的抗坏血酸含量和GR活性通常也比当年的云杉针叶更高。
来自过量光合产物的储备对于胁迫防御过程中的呼吸和维持新陈代谢至关重要。通常，常绿多年生植物的ML储存的C和N作为碳水化合物，脂质，氨基化合物和蛋质的形式比年轻的叶子要多。在目前的椰枣幼苗研究中，YL的TAA含量往往比ML高，特别是在夏季气候下，主要是由于谷氨酸和天冬氨酸家族，3-磷酸甘油酸衍生的丝氨酸和甘氨酸以及丙氨酸中氨基酸的丰度提高。同样，在夏季，在红松和白云杉幼苗的针叶中也观察到了这些氨基酸的积累。在海枣叶中片，炎热的夏季气候下氨基酸含量的增加可能是增强的光合作用增强和受刺激的TCA循环的综合作用（图3）。
酚类化合物参与植物与其生物环境和非生物环境的许多相互作用。在本研究中，羟基肉桂酸衍生物及其前身莽草酸酯和苯丙氨酸在ML中的含量一直少于在YL中，这可能表明在硬度较低的YL中木质素从头合成的增强（图3）。此外，在YL中也积累了黄酮类花旗松素（图3）。这种酚类化合物具有很高的抗氧化和清除自由基的能力，在体外构成了脂质过氧化的良好抑制剂，并且在暴露于臭氧的海枣中增加了。
ML通常显示出比YL更高的饱和脂肪酸十二烷酸和十四烷酸以及α-生育酚和烟酸含量。此外，夏季气候中YL中的十七烷酸，十六烷酸，9,12-十八碳十二烯酸和9,12,15-十八碳三烯酸的丰度显著较高，但这些化合物在YL中的积累在冬季气候中消失了（图3）。因此，我们的第三个假设必须修正，因为ML和YL中的脂肪酸谱都受到不同气候的显著影响。在烟草植物中也报告了叶龄依赖的磷脂含量的变化。作者推测这些变化可能与叶片发育过程中叶绿体以外的细胞器降解有关。根据目前的研究，我们推测在冬季，较低温度下这些脂质的选择性降解是维持膜流动性所必需的。
总之，夏季的高温气候构成了海枣幼苗的胁迫条件，因此导致ROS水平升高。DHAR活性增强并伴有抗坏血酸合成减少，不足以维持夏季气候下的H2O2水平。与花旗松针叶和拟南芥叶相反，相容性含氮溶质以及肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量提高，有助于防止对海枣叶片的氧化损伤，表明对气候变化的物种特异性生理反应。除ROS水平外，抗氧化剂和相容性溶质，膜脂肪酸和酚类化合物作为细胞壁成分和ROS清除剂，在海枣叶片响应气候变化中也起着重要作用。尽管我们没有观察到气候与叶龄之间的统计学上显著的相互作用，但是不同温度的气候变化对促进耐高温的大量代谢调节的影响在很大程度上取决于叶片的发育。我们认为，海枣YL对气候条件的变化比ML更敏感，并且可能比ML更易受伤害。鉴于夏季生长和发育较快，在气候变化的背景下，海枣可能面临更严峻的挑战。
评论
海枣作为重要的经济树种，在全球广泛种植，而海枣还对多种环境具有耐性。随着全球气候变化，全球气温逐渐升高，与此同时海枣的栽培也面临巨大的挑战。该研究通过模拟夏季气候和冬季气候环境，研究了海枣幼叶和成熟叶片的生理变化和代谢物变化，研究表明气候条件对海枣叶片的生理具有显著影响，海枣叶片可以通过谷胱甘肽循环以及其他生理机能来适应升高的温度，如可以通过增加多种次级代谢物的含量进而增加相容性溶质的含量来抵御高温的影响。本研究还验证了前人的研究结果，即气候条件影响了叶片中脂肪酸的含量，通过改变饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例来适应不同的温度变化。此外，本研究发现海枣幼叶对气候变化更敏感，但是从长远意义上讲这种敏感性可能对于海枣面对未来不断变化的气候条件更加重要！
原文网址：https://academic.oup.com/jxb/article-abstract/70/20/5959/5543301