编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
复杂的生物体可快速的诱导基因的选择性表达以应答多样的环境变化，这一调控发生在组蛋白凝集到染色质的大基因组中。通过巨噬细胞识别病原体参与保守的信号通路和转录因子来协调诱导炎症因子的表达。组蛋白H3.3是祖先级别的组蛋白H3突变体，其富集是动态调节染色质和转录因子的普遍特征。然而，染色质在诱导的基因处是如何调节的以及H3.3是如何快速升高到较高的转录水平尚不明确。H3.3的氨基酸包含一个特异的Ser31，该残基在“经典的”H3.1和H3.2中是缺失的。在本研究中研究者发现在小鼠巨噬细胞中H3.3S31磷酸化（H3.3S31ph）以依赖刺激的方式快速诱导基因表达。响应刺激基因的选择性标记是活化转录机制的一种成分：甲基转移酶SETD2，并且排斥延伸的共抑制因子ZMYND11。研究者发现H3.3是刺激诱导基因的特征，包括H3.3S31ph，更易进入转录装置。研究者的结果揭示了一种能够使包括组蛋白突变体H3.3快速转录、磷酸化以及排斥染色质调节因子的机制。
原名：Histone H3.3 phosphorylation amplifies stimulation-induced transcription
译 名：组蛋白H3.3增强刺激诱导的转录
期刊：nature
影响因子：42.778
发表时间：2020年7月20日
作者：Steven Z. Josefowicz、李海涛教授
单位：康奈尔大学、清华大学以及洛克菲勒大学
DOI：10.1038/s41586-020-2533-0
刺激诱导基因的如何高效的进入转录机制并且表达尚不清楚，热休克基因或者炎症基因选择性的诱导转录是快速粗暴的，尽管这些基因表达发生在数以千计构成型基因中。考虑到刺激诱导的转录可能受染色质调节机制与信号活化转录因子的协同作用调控，在刺激响应的染色质特征中，组蛋白磷酸化可能是通过酶的级联反应将信号传递至刺激响应基因扩大转录的有效且潜在的方式。H3.3是保守的、祖先级别的H3突变体，并且是一些简单的真核生物中H3存在的唯一形式，包括酿酒酵母。在复杂的生物体中，H3.3在细胞周期外特异表达，并且在转录、基因组稳定和有丝分裂中具有多个作用，而所谓的经典H3.1和H3.2组蛋白以依赖复制的形式表达以适应双倍基因组。H3.3氨基端尾巴与H3.1或者H3.2的一个氨基酸不同，在H3.3的31位点是丝氨酸而在H3.1和H3.2中是丙氨酸（图1a）。尽管H3.3在动态的染色质中富集，H3.3S31以及H3.3特异的磷酸化潜在的调节功能和生物机制尚不清楚。近期的研究发现H3.3在转移中作为诱导因素，及非洲爪蟾原肠形成以及胚胎干细胞分化中H3.3S31及其磷酸化的重要性。在本研究中，研究者报道了H3.3在Ser31 (H3.3S31ph)磷酸化增强了快速、高水平、刺激诱导转录的协调机制。
H3.3在诱导基因上的磷酸化
为了确定细胞刺激过程中可能参与染色质调节机制的染色质调节因子，研究者纯化了用细菌脂多糖LPS处理的小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)，并且利用质谱技术对组蛋白翻译后修饰（PTMs）进行定量。H3.3S31ph在静息的巨噬细胞中并未检测到，但是在刺激后水平升高，而H3.3蛋白的整体水平仍未改变。综合分析发现了刺激后其他组蛋白PTMs的微小改变。为了进一步研究H3.3S31ph，研究者开发了一种高度特异的抗体。免疫印迹实验分析证实H3.3S31ph的刺激诱导和快速动力学与ERK磷酸化平行（图1b）。显著的是，考虑到有丝分裂中组蛋白的磷酸化，包括H3.3S3123，BMDMs有丝分裂后的特性能够使研究者将刺激相关组蛋白磷酸化从有丝分裂事件中区分出来。由于H3.3S31的保守性，研究者假定其磷酸化与不同的细胞内刺激应答相关。研究者发现在其他四个细胞系中刺激依赖的H3.3S31ph，每个对应特异的生理刺激条件：骨髓衍生的树突细胞(BMDCs)受LPS刺激；NK细胞受IL-12和IL-18刺激；初始B细胞受CD40、IGM抗体以及IL-21的刺激；原代皮层神经元受脑衍生的营养神经因子（BDNF）的刺激（图1c）。
为了确定H3.3S31ph的基因组定位，研究者通过染色质免疫共沉淀及高通量测序ChIP-seq技术对静息状态的以及LPS刺激60分钟后的BMDMs进行分析。研究者将H3.3S31ph的定位与H3S28ph进行比较，研究者在之前的报道中发现H3S28ph在增强子区域、启动子区域以及横跨刺激诱导基因的基因区间沉积。与H3S28ph相似，H3.3S31ph同样依赖刺激，但是更严格的在LPS诱导基因的body区域（从转录起始位点到转录终止位点）（图1d）。
H3.3S31ph的ChIP–seq分析发现它特异的沉积在刺激诱导基因，而不是构成性表达基因的普遍特征。为了以无差别的方式确定H3.3S31ph 富集的基因，并且挖掘基因H3.3S31ph ChIP信号与刺激诱导基因的关系，研究者进行了两组独立的全基因组分析：一组基于ChIP峰值，一组基于ChIP注释所有基因的密度排序。这些正交方法获得了高度重合的基因组，并且GO分析也发现刺激诱导的本质：响应压力、免疫系统过程以及对化学刺激的细胞反应（图1e）。因此H3.3S31ph在基因上再次选择性沉积，信号诱导的转录揭示了在刺激响应的转录中扮演的角色。
研究者的全基因组分析与之前的报道一致：刺激诱导Tnf位点的H3.3S31ph受IKKα与Pol II相互作用的调节。除了IKKα，还有其他激酶包括CHK1和aurora B。为了确定BMDMs中的激酶并且确定与转录周期相关的活性，研究者进行了一系列的药理和敲除实验。利用P-TEFb的抑制剂flavopiridol通过封闭Pol II的延伸消除了H3.3S31ph，除了TSS的些许效果（图2a、b）。利用camptothecin对TOP1的抑制，由于扭转应力刺激在基因body内对Pol II拖延，在整个基因body内降低了H3.3S31ph，并且发现在长基因H3.3S31ph的5’封闭，例如Malt1和Rasgef1b。通过etoposide对TOP2抑制同样降低了特定的基因（IL6）上的H3.3S31ph，可能是在那些双链断裂调节的增强子-启动子环路（图2a、b）。在H3.3S31ph基因上NF-κB靶基因的富集以及CHK1扰乱的微小效应提示该激酶可能是IKKα。研究者发现IKKα以刺激依赖的方式坐落在H3.3S31ph基因上（图2c）。此外利用IKKα特异的pan-IKK抑制剂以及shRNA导致炎症基因上的H3.3S31ph丧失（图2d）。显著的是，依赖IKKα的H3.3S31ph发生在一系列刺激诱导的基因（图2e），也包括那些非NF-κB的靶基因，这与IKKα与其他转录因子相互作用的潜能是一致的。因此，IKKα能够与延伸的Pol II相互作用并且共转录H3.3S31ph。IKKα在转录上的作用需要进一步探究。
图1 在巨噬细胞应答病原体识别中组蛋白H3的突变体H3.3在刺激诱导基因上磷酸化
H3.3磷酸化刺激SETD2
考虑到H3.3S31ph可能通过某机制调节转录，研究者聚焦于与H3K36me3共转录的关联。H3K36me3受单独的组蛋白甲基转移酶HMT——SETD2的调节，而其他的H3K36甲基转移酶只能单甲基或者二甲基化H3K36。SETD2和H3K36me3在转录、基因组DNA甲基化以及mRNA剪接中扮演重要角色。研究者发现在刺激诱导基因上H3.3S31ph和H3K36me3具有相似的基因body定位（图2a、c、f）。显著的是，尽管在诱导基因上H3.3S31ph依赖刺激，在静息的状态下H3K36me3水平适中，而在刺激后与H3.3S31ph同样升高（图2f、g），这可能代表一个特异的转录稳态。
图2 H3.3S31被IKKα 共转录磷酸化，与H3K36me3一致沉积在应答基因的基因体内
鉴于H3.3S31ph和H3K36me3之间的关联以及它们在H3.3尾巴物理邻近（图1a），研究者猜想H3.3S31ph可能使刺激诱导的基因具有扩大转录的能力，部分通过H3K36me3沉积的刺激。为了验证这一假说，研究者在体外评估了SETD2中SET结构域对rNucs中重组核小体底物的酶活性，利用野生型的H3.3尾巴序列或者在31号残基磷酸模拟谷氨酸突变体（S31E），经过一定的反应时间通过免疫印迹对H3.3K36上SETD2的HMT活性进行检测，在进行这些实验时研究者利用K36 HMT NSD2作为对照组。利用对K36me2和K36me3特异的抗体，在检测时间进程中两种酶聚集了各自的产物，尽管SETD2的活性被磷酸模拟H3.3S31E突变体刺激，而NSD2的活性降低（图3a）。此外，利用自然的核小体底物，半合成的'设计’核小体(dNucs)，研究者通过定量免疫免疫印迹观察到H3.3S31ph可扩大SETD2的活性（图3b）。SETD2的SET结构域的结构研究发现当延伸到催化位点时沿着H3 N端尾巴互补。研究者推测SETD2的基础互补能够特异的增强与H3.3S31ph核小体的相互作用并且扩大酶的活性。因此，研究者解决了人类SETD2中与肽段H3.3S31phK36M在1.78 Å结合的催化结构域的晶体结构（图3c）。在结构中，H3.3肽段嵌入到SETD2底物结合的通道。H3.3的N端从活性位点延伸到SETD2底物通道的出口，并且被基础的残基富集。H3.3S31磷酸化组电子的密度是显而易见的。H3.3S31ph的磷酸化组与SETD2的K1600和K1673间存在静电吸引和水介导的氢键相互作用（图3d）。这两个残基为底物通道提供了正电荷以供H3.3S31ph识别，因此促进了H3.3K36在活性位点的甲基化。基于K1600和K1673在H3.3S31ph和SETD2相互作用之间的重要性，研究者评估了系统发育以及H3K36甲基转移酶中这些氨基酸残基的序列保守性。显著的是，研究者发现K1600和K1673的基础残基只在后生动物SETD2中是保守的。相反，其他的H3K36 HMTs（NSD家族）在这些位置则被替换成酸性的或者极性氨基酸，这可能也解释了NSD2在H3.3S31E底物上的活性降低。为了直接评价参与H3.3S31ph保守SETD2赖氨酸残基的功能，研究者构建了SETD2 SET结构域的突变体(K1600E, K1673E以及dual K1600E/K1673E)，并且进一步在未修饰的、包含H3.3S31E的rNucs以及H3.3S31ph dNucs上测定了活性。研究者再次观察到在未修饰核小体上H3.3S31E rNucs潜在的刺激活性（图3e）。然而在单独的突变体，K1600E和K1673E上H3.3S31E扩大的SETD2活性丧失，在双重的K1600E/K1673E突变体上逆转（图3e）。研究者利用对SETD2 HMTase活性进行了不依赖抗体的定量分析结果发现SETD2与非修饰的核小体相比，与H3.3S31E rNuc或者H3.3S31ph结合SAH聚集升高，并且在SETD2 K1600E/K1673E以及更加保守的SETD2 K1600A/K1673A突变体中相对的升高丧失。总之，细胞、表观以及结构——功能研究提示H3.3S31ph扩大SETD2的活性是增强刺激诱导转录的特征。因此，刺激诱导基因可能被赋予了更易被接近SETD2以更快更高水平的表达。与这一猜想一致的是，研究者发现LPS诱导的基因表达，H3.3S31ph高度依赖SETD2,。尽管在体外H3.3S31ph能够刺激SETD2，H3.3S31ph与细胞内一些炎症基因同步改变相关，研究者预测在体内也存在这样的情况。
图3 H3K36me3的甲基转移酶SETD2受H3.3S31ph刺激
H3.3S31ph排斥ZMYND11并且诱发转录
对H3.3尾巴调控热点Ser31位庞大、负磷酸化的介绍可能对H3尾巴上结合的因子具有普遍的重要性，包括H3K27和H3K36。为了探究H3.3S31ph作为开关还是结合的基序，研究者进行了三个H3识别器的模型分析，H3识别器可能受H3.3S31ph的影响。一些因子包括H3K27me3去甲基酶KDM6B更易结合H3.3S31ph，而其他的因子则从H3.3S31ph排出，包括PHF1，H3K27me3甲基转移酶复合体中的成分。尽管在转录的基因体内，刺激的巨噬细胞特征是H3.3S31ph，在发育以及细胞分裂的背景下，H3.3S31是否具有更广阔的染色质内有丝分裂磷酸化使得H3K27me3去抑制从而影响发育的进程。H3.3S31ph可能是转录共抑制因子和转录抑制因子ZMYND11的外排开关。ZMYND11是H3.3 K36me3的识别器，通过与未修饰的S31相互作用并且定位在基因体内。对ZMYND11结构和生物化学的研究，结合研究者自己的模型以及ITC滴定实验（图4a）发现H3.3S31phK36me3能够外排ZMYND11。研究者认为ZMYND11可能限制了炎症基因的表达，而刺激诱导的H3.3S31ph可能外排ZMYND11并且去抑制靶基因的表达。显著的是，炎症基因倾向于早已存在ZMYND11的底物——H3.3K36me3，尽管在静息状态下，直到刺激后转录并不充分。通过比较静息和刺激后的BMDMs进行的ZMYND11的ChIP-seq结果，研究者发现ZMYND11与一些刺激诱导的基因是先结合的，外排与H3.3S31ph是同时发生的（图4b、c）。与ZMYND11在限制炎症基因表达一致，利用ZMYND11的siRNA发现Tnf, Junb以及Nfkbia的表达扩大（图4d）。此外，ZMYND11外排依赖IKK信号通路，在细胞受LPS刺激之前利用IKK抑制剂处理发现ZMYND11能够抑制炎症因子的表达（图4e）。ZMYND11和IKKα的靶基因共同结合的诱导基因上H3.3S31ph高度富集。因此，一些刺激诱导的基因具有可区分的染色质特征：（1）活性染色质的状态以及早已存在的H3.3K36me3；（2）先与ZMYND11辅因子结合；（3）刺激诱导H3.3S31ph；（4）外排ZMYND11。除了ZMYND11的调节，研究者最初对KDM6B和PHF1的研究提示在巨噬细胞以及其他具有H3.3S31ph特征的细胞系中H3.3S31ph具有额外的调节功能（图1d），强调了（a）识别器外排（b）在双重H3.3S31phK36me3北京下的结合识别。组蛋白的功能干扰受它们在细胞内多样的功能以及多个基因拷贝中扮演的重要角色影响。然而由于只有两个包含S31残基的组蛋白H3.3突变体基因，研究者通过CRISPR技术靶向这些基因。H3.3是胚胎发育和精子发生所必需的。此外，H3.3在炎症因子上富集，尽管功能尚不明确。为了研究H3.3在炎症因子诱导中发挥的功能，研究者通过CRISPR H3f3a 和H3f3b靶向构建了H3f3a H3f3b双敲除的RAW264.7巨噬细胞系，并且筛选了亚等位基因的RAW264.7克隆，携带无效的H3f3a等位基因，以及一个HYPO H3f3b等位基因。对这些细胞系中静息状态和刺激态的细胞进行RNA测序（RNA-seq），结果发现在DKO和HYPO巨噬细胞中LPS诱导基因的表达持续降低。为了直接确定细胞中H3.3S31ph的功能，研究者在LPS刺激之前利用野生型H3.3S31A（功能丧失）以及H3.3S31E（功能获得）转基因对H3.3 DKO巨噬细胞进行补救，并且分析了刺激诱导的转录本。时间进程的反转录定量PCR(RT–qPCR)对Tnf 和Ccl4进行表达发现（1）在DKO细胞中诱导减少；（2）利用野生型H3.3转基因能够补救基因表达；（3）利用H3.3S31A诱导减少；（4）磷酸化模拟物H3.3S31E具有潜在的功能获得，使细胞内的表达升高（图4f）。为了更广泛的评估H3.3S31突变体的效应，研究者对DKO和H3.3转基因诱导的巨噬细胞进行LPS刺激后进行RNA-seq。主要的成分分析发现H3.3 DKO和H3.3S31A集簇是独立的，而野生型的H3.3和H3.3S31E集簇是一起的，具有较高的PC1，与补救的表型是一致的（图4g）。总之，H3.3 DKO巨噬细胞中LPS诱导的基因通过野生型H3.3反转表达升高，通过H3.3S31A表达降低，而通过H3.3S31E表达升高（图4h）。研究者猜想在巨噬细胞样细胞系中细胞表型的这一范围反映了H3.3和H3.3S31ph的功能，包括SETD2活性的协调刺激（图3）以及抑制因子ZMYND11的外排（图4）。
图4 H3.3S31ph外排转录抑制因子ZMYND11并且刺激转录
专一的机制能够快速刺激诱导的转录与多个细胞应答和疾病状态相关，并且可能比常规的转录机制表现出更多可选择的治疗靶向。研究者的结果使H3.3S31ph在刺激诱导的基因上选择性沉积以扩大SETD2的活性、共转录H3K36me3以及ZMYND11的外排，使得这些基因的转录快速达到高水平（图4i）。总之结合在早期刺激诱导染色质的活化时H3S28磷酸化的特征，这些结果解释了组蛋白磷酸化在再次转录中扮演的角色。研究者发现了染色质特异的特征例如组蛋白磷酸化更特异的到达转录装置，使细胞能够快速应对多样的环境应答。
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