（CRISPR interference）慢病毒载体系统

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR Associated Protein 9（CRISPR/Cas9）系统是近年新兴的基因编辑工具之一，另外两种是ZFN和TALEN。由于CRISPR/Cas9的构建更简易，超越了更早开发的ZFN和TALEN技术，成为现今基因编辑领域最炙手可热的技术。CRISPR/Cas9技术源于原核免疫系统CRISPR/Cas。在自然界中，细菌利用CRISPR/Cas抵抗质粒和噬菌体等外源遗传物质的入侵，从而保持自身基因组的完整性。

两个生物大分子，Cas9蛋白和gRNA（guide RNA）组成了CRISPR/Cas9基因编辑系统。在细胞内，Cas9蛋白与gRNA形成复合物，能特异性鉴别出靶序列。此过程中，Cas9蛋白负责将复合物定点到靶DNA和剪切靶DNA。Cas9蛋白有6个结构域，分别是Rec I、Rec II、Bridge Helix、PAM Interacting、HNH和RuvC。Rec I是6个中最大的一个结构域，负责结合gRNA。一旦结合了靶DNA，Bridge Helix就负责启动剪切。PAM interacting结构域赋予Cas9对PAM序列的特异性要求，负责启动与靶DNA的结合。HNH和RuvC都是核酸酶结构域，剪切单链DNA。

图1. Cas9蛋白结构域

在没有结合gRNA的情况下，Cas9蛋白保持失活状态。gRNA是一条单链RNA，会形成一个T型结构。在这个T结构里，有几个显著的特征：tetraloop、3个stem loop和5’ 端与靶DNA互补的序列。

图2. gRNA结构

一旦gRNA结合上Cas9蛋白，就会引起Cas9蛋白的构象改变。这种构象的改变使得Cas9蛋白从失活状态变成了活性状态。

图3. Cas9构象改变

一旦Cas9蛋白被激活，它就开始寻找靶DNA。此过程中，它首先结合到含有PAM（protospacer adjacent motif）序列的序列。一段PAM序列就是2个或者3个碱基序列，位于与gRNA互补的靶DNA序列的下游，紧跟着靶DNA序列。不同的CRISPR系统含有不同的PAM序列，例如：广泛应用的Streptococcus pyogenes Cas9的PAM序列是5′-NGG-3′。Jiang等人证明SpCas9也可以识别NAG，但是效率较低。当Cas9结合到含有PAM序列的潜在靶DNA序列，它会解开PAM的上游双链DNA序列。此时，gRNA的5’ 端序列与解开的序列配对。一旦配对成功，RuvC和HNH核酸酶结构域就会在PAM序列上游的第3个碱基和第4个碱基之间切开。RuvC剪切下链，HNH剪切上链。

图4. Cas9结合并剪切靶DNA

CRISPRi技术依靠生成一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白。这是通过往RuvC和NHN两个核酸酶结构域分别导入氨基酸突变D10A和H840A，使得Cas9蛋白失去切割DNA活性，但仍保留结合DNA的能力，这样的Cas9 称之为dCas9（Dead Cas9）。

图5. dCas9结构域

当dCas9被引导到某个基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。为了进一步提高转录抑制的效率，dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB（krüppel-associated box）结构域，这样的蛋白称之为dCas9-KRAB。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域（bipartite repressor domain）KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。

图6. dCas9-KRAB CRISPRi工作原理

一个完整的dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统包含两个部分，gRNA表达载体和dCas9-KRAB（或者dCas9-KRAB-MeCP2）表达载体。设计基因抑制实验时，只需要设计打靶目的基因的gRNA表达载体即可。

图7. dCas9-KRAB CRISPRi慢病毒载体系统