科研 | PNAS：食品药品添加剂对肠道药物吸收的抑制可以被细菌代谢解除 / 开普饭

编译：mallow，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

食品和药品中含有大量小分子添加剂（赋形剂），对人体生理、药物安全及药物应答的影响尚不清楚。《PNAS》上发表的一项最新研究，通过对136种赋形剂进行筛选，鉴定出24种有效的OATP2B1（一种肠道转运蛋白）抑制剂，其中FD&C Red No.40可抑制小鼠的OATP2B1对非索非那定（一种抗组胺药物）的吸收。在体外实验中，肠道菌群可通过代谢FD&C Red No.40等OATP2B1抑制剂并使其失活，导致其代谢产物无法抑制OATP2B1。该研究提示，一些食品添加剂及药用辅料可能抑制肠道的药物吸收，肠道菌群可通过代谢这些添加剂，以恢复肠道的药物吸收。

论文ID

原名：Bacterial metabolism rescues the inhibition of intestinal drug absorption by food and drug additives

译名：细菌代谢逆转食品药品添加剂对肠道药物吸收的抑制作用

期刊：PNAS

影响因子：9.504

发表时间：2020.6

通讯作者：Kathleen M. Giacomini & Peter J. Turnbaugh

通讯作者单位：加州大学

Web results那不勒斯腓特烈二世大学

实验设计

针对肠道关键转运蛋白OATP2B1筛选136种赋形剂，鉴定出并确认了24种潜在的OATP2B1抑制剂（具有较高的分子量及疏水性，多数为染料，包括8种偶氮染料）；在小鼠中，FD&C Red No.40（OATP2B1抑制剂之一，一种常用偶氮染料）可降低血浆中的非索非那定水平，后者为OATP2B1的底物，提示FD&C Red No.40可能抑制肠道的药物吸收；在体外实验中，健康人的肠道菌群可代谢FD&C Red 40号使其失活，代谢产物无法抑制OATP2B1。

实验过程中用到的技术方法有：建立稳定的OATP2B1过表达细胞系和细胞培养（人OATP2B1 cDNA克隆到pcDNA 5/FRT哺乳动物表达载体中，并使用Lipofectamine LTX转染到Flp-In 293细胞中）；DBF摄取动力学测定；筛选OATP2B1摄取抑制的赋形剂库和IC50测定；OATP2B1赋形剂抑制剂的理化性质（分子量，重原子数，旋转键数，分子体积，氢键供体数量，氢键受体数量，总极性表面积等）分析；非索非那定药代动力学研究（8至10周龄雄性Pgp缺陷mdr1a/b-/-小鼠）；分离和筛选人类肠道细菌中偶氮染料赋形剂的代谢；测定细菌条件的含偶氮染料的培养基对OATP2B1吸收的抑制作用；小鼠粪便样品中定量提取FD&C Red No.40；估算赋形剂最大肠道浓度。

结果

1 多种口服赋形剂抑制OATP2B1介导的转运

作者通过开发体外测定法来鉴定抑制OATP2B1的赋形剂，从而系统地筛选常见药物赋形剂和OATP2B1之间的相互作用。OATP2B1位于肠道顶端膜并介导许多口服处方药的吸收，包括他汀类药物氟伐他汀和罗伐他汀，抗组胺剂非索非那定和β-肾上腺素受体阻断剂阿替洛尔。抑制OATP2B1转运的化合物会降低很多药物的吸收。为了鉴定与OATP2B1相互作用的赋形剂，作者组装了一个独特的分子赋形剂库来筛选OATP2B1转运抑制作用。共计136种口服赋形剂，涵盖多种功能类别，包括染料，缓冲剂，抗微生物剂和调味剂（图1A）。该赋形剂系列并非药物专用，系列中的65％也在食品中发现。作者开发了一种体外测定法以鉴定OATP2B1介导摄取的潜在抑制剂。将人OATP2B1互补DNA克隆到哺乳动物表达载体pcDNA5/FRT中，并转染到人胚肾Flp-In细胞中，生成稳定的OATP2B1过表达细胞系。选择人胚肾细胞用于筛查是因为它广泛用于功能性转运蛋白表达测定，且固有的药物吸收率低。荧光分子4',5'-二溴荧光素（DBF）被用作筛选OATP2B1摄取的底物。通过比较过表达细胞系和对照细胞系（空载体pcDNA转染的人胚肾Flp-In细胞）确认OATP2B1在DBF摄取中的作用，揭示了OATP2B1过表达条件下摄取显著增加（图1C）。内源性OATP2B1底物硫酸雌酮可显著抑制DBF的摄取（图1C）。结果表明作者可靠且可重复地测量了OATP2B1依赖性DBF摄取的速率。使用经过验证的分析方法筛选抑制DBF摄取的赋形剂库。赋形剂筛选浓度为200μM。筛选标准为抑制OATP2B1吸收>50％。初步筛选了24种抑制剂（图1D）。随后进行剂量反应抑制试验验证24种赋形剂。这项分析验证了初步筛选中发现的100％抑制剂（图1E），为我们的>50％抑制阈值提供了支持，并表明仍有待发现其他赋形剂抑制剂。6种赋形剂是OATP2B1介导摄取的有效抑制剂，抑制常数（Ki）≤1.0μM。使用内源性OATP2B1底物雌酮硫酸盐进一步验证2种赋形剂摄取抑制剂FD＆C Red No.40和FD＆C Yellow No.6。对24种赋形剂抑制剂进行聚集试验，9种赋形剂的Ki值大于其聚集浓度的10倍，表明对OATP2B1有特异性抑制作用。

图1 （A）筛选中包含的136种口服分子赋形剂的功能类别；（B）人OATP2B1介导的DBF摄取的动力学；（C）DBF摄取；（D）136种赋形剂对OATP2B1摄取的抑制结果；（E）赋形剂对OATP2B1转运的剂量反应曲线。

2 与非抑制剂相比OATP2B1摄取的赋形抑制剂具有独特的理化和功能特性

鉴定出的OATP2B1转运抑制剂在化学和功能上具有多样性，其中包括染料，表面活性剂，抗微生物剂和调味剂（图2A）。尽管有这种多样性，仍然能够鉴定OATP2B1抑制剂的特征。赋形剂抑制剂的多种理化特性相对于非抑制剂来说是不同的，包括分子量增加（图2B）和亲脂性（图2C）。作者还发现，相对于整体，OATP2B1抑制剂的染料含量显著增加，占抑制剂的75％（图2A）。

图2 （A）筛选出的OATP2B1抑制性赋形剂的组成；与非抑制剂相比，赋形剂抑制剂的（B）分子量和（C）溶解度。

3 口服OATP2B1转运赋形剂抑制剂FD＆C Red No.40降低小鼠中非索非那定的生物利用度

OATP2B1在非索非那定的吸收中起重要作用，并且是食品与药物相互作用的靶标。偶氮染料赋形剂FD＆C Red No.40是美国食品药品管理局批准使用量最高的染料，并广泛用于食品和药品，因此选其进行体内研究。在P糖蛋白缺乏（mdr1a/b-/-）小鼠中检查了FD＆C Red No.40对非索非那定生物利用度的抑制作用，因为非索非那定也是P糖蛋的底物，可降低非索非那定的吸收。与对照组相比，同时施用25 mg/kg FD＆C Red No.40（估计的肠道浓度为10 mM）将血浆浓度-时间曲线（AUC0-360）下的非索非那定面积减少了48％（图3 A和C）。还观察到了峰值血浆浓度降低的趋势（图3D）。相反，2.5 mg/kg的FD＆C Red No.40（估计的肠道浓度为1 mM）导致非索非那定的水平与对照相当（图3A-D）。

图3 （A）非索非那定的血浆浓度-时间曲线；（B-D）计算的药代动力学参数：（B）血浆非索非那定AUC0-120min；（C）血浆非索非那定AUC0-360min；（D）最大血浆浓度Cmax。

4 人肠道细菌能够代谢偶氮染料赋形剂

在被确定为OATP2B1运输抑制剂的18种赋形剂染料中，有8种属于偶氮染料家族：具有一个或多个偶氮键的合成染料（官能团R-N=N-R'）。偶氮还原酶促进偶氮键的还原性切割，偶氮还原酶由系统发育多样的细菌编码，包括在人类胃肠道中普遍存在的多种细菌类群。由于偶氮染料赋形剂是口服给药，因此有机会与细菌偶氮还原酶相遇并被其裂解，从而改变其化学结构和生物活性。尽管有一个偶氮键，但偶氮染料在结构上是多样的，并且对细菌的还原表现出不同的敏感性。此外，肠道细菌对在筛查中鉴定出的特定偶氮染料的代谢能力了解甚少。为了测试复杂的人类肠道菌群代谢八种已鉴定的偶氮染料OATP2B1抑制剂的能力，进行了离体筛选，其中每种偶氮染料赋形剂与来自3个不相关健康人体的粪便样品进行厌氧孵育。偶氮键还原后，这些染料失去发色性变为无色。所有测试的染料均被人类肠道细菌清除（图4A）。染料之间消除染料的程度有所不同，表明这些酶显示出一定程度的底物特异性。

开发一种基于琼脂平板的测定法以鉴定能够进行赋形剂偶氮染料代谢的人肠道细菌分离株。将人粪便悬浮液的稀释液涂在补充有偶氮染料的琼脂平板上，并进行厌氧培养。通过检查琼脂平板上是否产生了染料清除区域（指示了偶氮键的裂解）的菌落来鉴定代谢物（图4B）。选择代表性的阳性分离株，并在含偶氮染料的培养基上再涂复，以确认其表型（图4B）。使用基于PCR的指纹图谱方法从同一受试者中复制菌株。在多种染料之间观察到了来自单个人类受试者的相同细菌指纹。

为了更明确地测试每种分离物代谢多种染料的能力，选择26种独特的偶氮染料-赋形剂代谢细菌分离物进行16S rRNA基因测序。从肠道中发现的三个主要门中鉴定出细菌：拟杆菌，厚壁菌和放线菌。所有测试的细菌菌株均能够清除多种偶氮染料（图4C）。染料的清除效率主要取决于菌株，而不取决于染料。分析还揭示了偶氮染料赋形剂清除的系统发育特征，属于厚壁菌和拟杆菌门的细菌比放线菌显著活跃（图4C）。这些结果表明人类肠道细菌可以代谢多种赋形剂染料，并且代谢的程度受细菌分类学的影响。

接下来深入了解负责肠道细菌偶氮染料赋形剂代谢的基因和酶。从2个最活跃的门中选择了9种人类肠道细菌分离株进行测序：厚壁菌（1株多枝梭菌，1株酸奶瘤胃球菌）和拟杆菌（2株椭圆形拟杆菌，2株单形拟杆菌，2株普通拟杆菌和1株内脏拟杆菌）。搜索了与来自厚壁菌和拟杆菌门的5个与先前表征的肠道细菌偶氮还原酶具有显著序列同源性的预测蛋白。所有9个分离基因组均编码至少一个偶氮还原酶同源物。所有匹配项最高的都是AzoC，这是一种严格的厌氧产气荚膜梭菌的非经典偶氮还原酶，它使用黄素腺嘌呤二核苷酸作为辅因子，而不是黄素单核苷酸（图4D）。

该观察结果可在更广泛的肠道细菌参考基因组中推广。从IMG数据库中检索了22个其他参考基因组，这些基因组属于筛选中鉴定的6个细菌物种，包括两岐双岐杆菌（7个基因组），产气柯林斯菌（1个基因组），脆弱拟杆菌（8个基因组），椭圆形拟杆菌（2个基因组），单形拟杆菌（2个基因组）和内脏拟杆菌（2个基因组）。与新测序的基因组一致，除其中一个物种外其余所有物种的最高匹配均来自产气荚膜梭菌的AzoC。一个例外为两岐双岐杆菌，是鉴定的22种中活性最低的分离株（图4C），并且与来自大肠杆菌的AzoR密切相关（图4E）。这些结果表明，大肠杆菌中特征充分的AzoR可能无法代表人类肠道内偶氮还原酶的主要类别，即使对于其他革兰氏阴性菌（如拟杆菌）也是如此。

图4 （A）残留染料的浓度；（B）分离能够清除FD＆C Red No.40的人肠道细菌；（C）人肠细菌分离株显示出消耗偶氮染料赋形剂的可变能力；与来自大肠杆菌的AzoR或来自产气荚膜梭菌的AzoC进行比对时，来自九个新测序的基因组（D）和先前测序的参考基因组（E）的偶氮还原酶同源物的比对得分。

5 偶氮染料赋形剂的微生物代谢可拯救OATP2B1吸收抑制作用

基于我先前的观察结果假设偶氮染料赋形剂的细菌代谢会降低其抑制OATP2B1转运的能力（图2B）。为了检验该假设，分析在偶氮染料FD＆C Red No.40存在下生长的人细菌分离株的条件培养基对OATP2B1摄取的抑制作用。选择这种代表性的偶氮染料赋形剂是由于先前的体内结果（图3），同时它是FDA在美国认证的含量最高的染料，广泛用于食品和药品。显示完全清除FD＆C Red No.40的条件培养基样品未能抑制OATP2B1介导的雌酮硫酸盐摄取，而含有高水平FD＆C Red No.40的样品则抑制了摄取（图5A）。液相色谱高分辨质谱分析证实了条件培养基样品中FD＆C Red No.40的消耗。FD＆C Red No.40的清除水平与OATP2B1介导的雌酮硫酸盐摄取量显著相关（图5B）。为了更明确地测试OATP2B1抑制作用的降低是否是由偶氮染料赋形剂向下游微生物代谢物的生物转化所致，从8种偶氮染料抑制剂中分别检测了12种独特的代谢物。与偶氮染料底物相反，除一种相应的减少的代谢产物外，所有其他产物均导致DBF吸收水平超过50％临界值，表明其抑制OATP2B1转运的能力下降（图5C）。一个例外（D＆C Orange No.4的代谢物）具有更高的抑制常数（图5D）。这些体外数据表明肠道细菌的偶氮还原酶活性可以挽救偶氮染料赋形剂对OATP2B1吸收的抑制作用。

图5 （A）抑制OATP2B1摄取的能力；（B）FD＆Cred No.40含量与OATP2B1介导的[3H]雌酮硫酸盐摄取有关；（C）偶氮染料及其相应的还原代谢产物抑制OATP2B1介导的DBF吸收；（D）D＆C Orange No.4及其代谢产物1-氨基-2-萘酚对OATP2B1介导的DBF吸收的剂量反应曲线。

6 CONV-R鼠和定菌鼠中肠道菌群，偶氮染料赋形剂与药物吸收间的相互作用

小鼠模型中的实验为偶氮染料赋形剂FD＆C Red No.40和肠道微生物组对OATP2B1底物非索非那定的吸收提供额外的支持。相对于无菌对照，常规饲养（CONV-R）的野生型BALB/c小鼠排泄的FD＆C Red No.40（口服剂量5 mg/只）显著降低（图6A）。在未经处理的CONV-R小鼠中未检测到染料。在粪便样品中也可以检测到FD＆C Red No.40（剂量较低25 mg/kg），导致非索非那定的生物利用度降低，但并非在血浆非索非那定水平无法与对照区分开的最低测试剂量（2.5 mg/kg）下（图3和6B）。根据以上结果，作者假设肠道细菌的偶氮还原酶活性可能在高的偶氮染料水平下达到饱和，即使存在偶氮染料的赋形剂代谢菌株，也会导致OATP2B1抑制。与此假设相一致，无菌小鼠在2个不同的合成群落中定殖，这2个群落分别由前3个和后3个FD＆C Red No.40代谢物组成，导致染料排泄的水平与无菌对照组没有区别（图6A）。偶氮还原酶在各种细菌类群中的冗余性以及较高的定殖水平（图6C和D）可以解释为什么CONV-R小鼠能够比定菌小鼠（图6A）更好地清除偶氮染料。在定菌小鼠和无菌小鼠中肠道通透性和基因表达的广泛差异可能会破坏赋形剂，肠道微生物组和药物转运蛋白之间的复杂相互作用。作者在无菌条件下重新获得了Pgp缺乏的小鼠模型，并重复了非索非那定药代动力学实验；但是与CONV-R小鼠不同（图3），高剂量的FD＆C Red No.40对无菌的Pgp缺乏动物的非索非那定的生物利用度影响较小（图6E-H）。需要更多的研究来确定机制，包括在没有肠道微生物组的情况下药物和赋形剂配置的差异。

图6（A和B）在24小时内回收粪便中的FD＆C Red No.40残留染料；相对于定菌组，CONV-R小鼠的（C）盲肠和（D）粪便中的总定植明显更高；（E）非索非那定的血浆浓度-时间曲线；药代动力学参数：（F）血浆非索非那定AUC0-120min；（G）血浆非索非那定AUC0-360min；（H）最大血浆浓度Cmax。

讨论

药物赋形剂平均占药物制剂的90％，尽管未经明确测试，但通常被认为是无活性的。然而，相似性整合方法表明，某些赋形剂在结构上与生物活性分子（包括药物）相似，并且可能共享其靶向活性。我们的结果证实并扩展了体外研究，表明赋形剂可以抑制肠道药物的吸收。通过全面筛选136种口服分子赋形剂，发现了24种肠道药物吸收转运蛋白OATP2B1抑制剂。这些赋形剂属于几种功能类别：包括染料，表面活性剂，抗菌防腐剂和调味剂，其中6种有望达到临床上相关的肠道浓度。本研究以及其他研究表明，药物赋形剂的生物活性比预期的要高，可能会影响药物治疗，人体生物学和病理生理学，这些都是未来研究的重要领域。尽管需要临床试验来确定这些赋形剂的体内作用，但是由于OATP2B1在药物吸收中的关键作用，这些发现具有潜在的临床意义。本研究的数据还为减轻食品和药物添加剂的生物活性提供了多种策略。其中包括确定作为OATP2B1底物的处方药和作为OATP2B1抑制剂的添加剂。

为了进一步评估抑制OATP2B1赋形剂的潜在临床相关性，根据最大允许量估算了赋形剂的最大肠道浓度。根据FDA关于转运蛋白在药物相互作用中的作用的观点，估计的肠道浓度（[I]）/Ki≥10的赋形剂有可能在临床相关浓度下抑制OATP2B1介导的药物吸收。如果最大允许量以单次推注方式给药，则6种赋形剂的[I]/Ki值超过10。一项调查报告称，2010年经FDA认证在美国使用的人造食用色素量平均为每人62毫克，其中FD＆C Red No.40占40％，FD＆C Yellow No.6占24％，FD＆C Blue No.1号占4％，FD＆C Red No.3占4％。基于62 mg/d，FD＆C Red No.40的[I]/Ki值为84.9，因此对药物吸收可能具有临床意义。

大多数口服药物产品都不含足够浓度的已确定的赋形剂，尤其是染料。食品中含量较高；但是日常饮食中消耗的染料通常不会与药物一起作为大剂量给药，从而降低了食品与药物相互作用的风险。在烘焙食品中可以发现高含量的单一赋形剂（例如FD＆C Red No.40），最高可达1240 mg/kg。一块100g的纸杯蛋糕，单份烘焙食品可能包含多达124mg的FD＆C Red No.40。一个成年人空腹的小肠总水量为43±14mL，表明单份烘焙食品后，FD＆C Red No.40的潜在肠道浓度可能高达10 mM。这些结果表明，虽然某种药物配方中的药物与染料的相互作用可能低于生理相关浓度，但通过某些食品消耗的染料可能会达到较高的肠道浓度，从而导致OATP2B1介导的处方药物吸收受到抑制。

尽管有这些预测，作者发现以2.5 mg/kg（估计肠道浓度为1 mM）的FD＆C Red No.40给药的小鼠并未显示非索非那定血浆水平的降低。体内缺乏这种抑制作用的一种可能解释是，2.5 mg/kg FD＆C Red No.40处于肠道微生物组偶氮还原酶活性的代谢能力之内，没有留下完整的染料，因此没有OATP2B1相互作用。粪便中缺少染料可支持这一观点（图6B）。另一方面，25 mg/kg（估计肠浓度为10 mM）FD＆C Red No.40使肠道微生物组的偶氮还原酶能力达到饱和，粪便中FD＆C Red No.40的水平可检测到（图6B）。抑制OATP2B1转运，从而降低非索非那定的吸收（图3）。

数据表明，OATP2B1转运的赋形剂抑制剂富含偶氮染料。这些染料易被人肠道细菌的偶氮还原酶代谢，产生不再抑制OATP2B1转运的代谢产物。虽然细菌分离数据为肠道微生物组差异可能改变偶氮染料代谢的可能性提供了一定的支持，但是这种酶活性在整个微生物群落和不同细菌分类群中的普遍存在和功能冗余表明微生物组的转变可能不会以有意义的方式促进赋形剂与转运蛋白相互作用中的个体差异。

药代动力学数据表明，在缺乏细菌偶氮还原酶活性的无菌小鼠中，FD＆C Red No.40给药对血浆非索非那定水平的影响不大。观察到25 mg/kg FD＆C Red No.40的非索非那定AUC0-120与2.5 mg/kg FD＆C Red No.40或对照相比明显降低。相反，尽管具有细菌的偶氮还原酶，CONV-R小鼠在较高的FD＆C Red No. 40（25 mg/kg）剂量下对非索非那定的吸收敏感。与CONV-R对应动物相比，无菌动物仍表现出明显的发育和生理差异，包括参与药物代谢和转运的基因表达的广泛差异。尽管OATP2B1基因的表达在无菌小鼠和CONV-R小鼠中似乎没有差异性，但是其他因素，例如OATP2B1蛋白水平和微生物代谢产物基质或OATP2B1抑制剂，也可能在高剂量FD＆C Red No.40时观察到的非索非那定转运抑制作用。CONV-R与无菌小鼠相比，在FD＆C Red No.40给药期间观察到的非索非那定吸收差异的机制仍需待进一步研究。

结论

食品和药品中补充有被认为是惰性的小分子赋形剂。研究筛选了一组常见的口服赋形剂，并确定了24种抑制肠道药物运输的物质，其中包括会降低小鼠药物吸收的常见赋形剂FD＆C Red No. 40。赋形剂抑制剂富含偶氮染料，可以被人类肠道细菌代谢，从而产生不再抑制肠道药物转运蛋白活性的代谢产物。本研究证明了口服赋形剂的不良后果，以及肠道微生物组在限制这些不利影响方面的有益作用。

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