科研 | Nature Biotechnology：小鼠肠道微生物的定向重塑抑制动脉粥样硬化的发展
编译：mallow，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道微生物组是具有延展性的微生物群落，对人类和动物的生理健康有着基本影响。肠道微生物组的调节可以促进慢性疾病的发作和发展，例如动脉粥样硬化，心血管疾病，肥胖症，糖尿病和中枢神经系统疾病。而包括饮食在内的各种因素可以通过重塑微生物组以及对宿主的直接作用在疾病中发挥重要作用。有鉴于此，美国斯斯克利普斯研究所的研究人员在《Nature biotechnology》上发表了关于肠道微生物影响人体健康的最新研究成果，发现口服可选择性修饰细菌生长的分子环状D,L-α-肽，以定向改造小鼠肠道微生物群，可降低血浆总胆固醇水平和动脉粥样硬化斑块，抑制动脉粥样硬化的发生。
论文ID
原名：Directed remodeling of the mouse gut microbiome inhibits the development of atherosclerosis
译名：小鼠肠道微生物的定向重塑抑制动脉粥样硬化的发展
期刊：Nature Biotechnology
IF：31.864
通讯作者：2020.6
通讯作者：M.Reza Ghadiri & Luke J. Leman
通讯作者单位：斯克利普斯研究所
实验设计
结果
1 两种状态的肠道微生物组模型
低密度脂蛋白受体无效（LDLr-/-）小鼠具有类似于人的脂蛋白谱，被广泛用作饮食诱导的动脉粥样硬化的动物模型，研究人员发现，LDLr-/-小鼠在饲喂日粮（CHD）时表现为健康，而饲喂西方饮食（WD）时表现为高脂血症和动脉粥样硬化。与饲喂CHD小鼠相比，WD饲喂LDLr-/-小鼠2周会导致其肠道微生物组重塑。因此，根据饮食的不同，LDLr-/-小鼠表现出两种不同的肠道微生物状态，这些状态与不同的表型结果相关（“WD状态”，表现为高脂血症和动脉粥样硬化表型；“CHD状态”，表现为健康表型）。因此，研究人员猜测，如果WD诱导的肠道微生物组是LDLr-/-小鼠的动脉粥样硬化发生发展的起因，那么将体内微生物群组成重塑为CHD状态或许可以改善疾病进展。
2 自组装环状D,L-α-肽作为合成细菌的生长调节剂
具有偶数个D-和L-α-氨基酸构型（通常为六个或八个残基）的环肽可以在有利于氢键结合的条件下（例如在脂膜环境中）自组装成扩展的β-折叠样的空心管状结构（图1a）。通过适当的选择序列，环状D,L-α-肽可以选择性地分配到细菌膜中，中断跨膜电位和/或离子梯度，损害细胞生长。作者假设口服给定的环状D,L-α-肽序列（经选择对肠道菌群的某些成员具有不同的细菌生长调节活性）可用于重塑微生物组。作者开发了一种整体筛选方法，用于评估化合物对肠道菌群的影响（图1b）。
3 整体体外筛选
作者在厌氧条件下通过手术切除盲肠，从WD条件下少2周的LDLr-/-小鼠中分离出新鲜的肠道微生物组。然后将盲肠内容物与生长培养基混合，分布在96孔板中，并在测试肽存在下孵育过夜。通过16S rRNA测序整体评估每种肽用于重塑肠道菌群的活性和选择性。作者的实验室有约1,500种不同的环状D,L-α-肽序列（纯的和光谱表征的），这些序列具有一系列抗菌活性和物种选择性。基于序列多样性和缺乏哺乳动物细胞毒性，本研究从该抗菌肽文库中选择了29种环状D,L-α-肽（图1c）。在整个筛选中观察到一系列微生物群重塑的效果，在很大程度上没有降低微生物群α多样性（群落中细菌类群的数量和均匀性）。在培养物中，有16种肽段显著提高了拟杆菌/厚壁菌的比率，3种肽段降低了比率。不同环肽活性的成对比较中发现了6个不同的肽簇，每个簇对微生物群的影响均不同于其他簇（图1d）。根据其对WD喂养的小鼠中大量生长细菌种类的抑制程度，最终选择2种多肽用于进一步的体内验证和功效研究：阳离子肽1（c[wLwKhShK]）和两性离子肽11（c[wLwReQeR]），它们在各自的肽簇中位居前列（图1d）。
图1 环状D,L-α-肽体外调节肠道菌群
4 肠道微生物组的体内定向重塑
作者在LDLr-/-小鼠中对环肽1和11进行了为期10周的研究，以确定该肽对肠道菌群和动脉粥样硬化的安全性和影响。环状D,L-α-肽的非生物结构使它们具有蛋白水解稳定性，可以口服。口服10周没有发现任何不适或毒性的迹象（体重，肝脏和脾脏重量，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平）。涉及肽1和11的药代动力学和排泄研究表明，这些肽是不可吸收的，在整个肠道中大部分保持完整，并通过粪便排泄得以清除，从而支持肠道作为行动的场所。
如体外筛选所预测的，由肽1处理2周内和由肽11处理6周内受试动物中拟杆菌/厚壁菌比率增加（图2a）。还观察到WD喂养的LDLr-/-小鼠肠道微生物组丰富度（Chao1指数）降低，但是向WD喂养的小鼠施用肽1和11逆转了这种降低，使肠道微生物组的丰富度恢复到与CHD喂养小鼠相似的水平。与体外筛选一致（图1c），两性离子肽11在体内对WD重塑的肠道细菌的选择性高于阳离子肽1（图2b）。这两种肽最初针对的是不同的细菌属，但在为期10周的研究过程中，由该肽诱导的重塑肠道微生物组变得更加相似。虽然肽处理后总体微生物群α多样性没有变化（图2c），经处理的动物中的微生物群与未经处理的动物不同（图2d）。在体外测定培养的物种水平上，总共鉴定出73个操作分类单元（OTU）。在未培养的小鼠盲肠样品中，在物种水平上鉴定出72个OTU。在这些样品中，42种同时存在于培养和未培养样品中。在这42种物种中，经过肽体内处理后，有14种物种的丰度发生了统计学上的显著变化，其他28种物种则不受肽处理的影响。在体内受到肽处理显著影响的14个物种中，大多数在体外测定中以相同的方式受到影响（图2e），表明该测定可以预测体内的变化。
图2 环状D,L-α-肽诱导的LDLr-/-小鼠肠道菌群的体内重塑
5 肠道菌群的转录重编程和代谢作用
对肽处理2周后的小鼠粪便中细菌进行转录组测序，发现肽处理可引起微生物群转录组的广泛重编程（图3a）。观察到的基因表达差异可以分为三个主要类群。两个簇包含通过肽处理表达增加（簇1）或降低（簇2）的细菌基因。簇3包含被WD改变但不受肽处理影响的基因。粪便样品中的大多数细菌种类都包含所有三个簇中存在的基因（图3），这不仅表明微生物结构的普遍变化，还表明微生物群转录活性的普遍变化。肽11处理降低了厚壁菌门基因表达，而增加了拟杆菌的总体基因表达。靶向代谢组学分析表明，肽治疗可恢复由WD损害的肠道菌群的重要功能。短链脂肪酸（SCFAs）和氨基酸的代谢如图（图3b，c）。SCFAs是由肠道中碳水化合物的细菌发酵产生的，并参与微生物对宿主代谢和生理的介导作用。在动脉粥样硬化的背景下，SCFAs可以通过组蛋白脱乙酰基酶和/或G蛋白偶联受体的依赖机制在先天免疫和炎症过程中发挥作用。功能宏基因组学分析表明，肽处理可诱导酶表达水平发生变化，导致丁酸酯生物合成和乙酰乙酸CoA转移酶水平增加（图3d），促进丁酸产生。粪便样品目标代谢组学分析结果证实用肽11治疗2周的动物含4-6个碳的脂肪酸（包括丁酸）水平升高（图3e）。在肽治疗的CHD或WD动物中，功能通路分析预测色氨酸和苯丙氨酸的分解代谢降低（图3c）。靶向代谢组学显示，经2周肽处理后的动物的粪便中色氨酸和苯丙氨酸含量较高（图3f）。
图3 WD喂养小鼠进行肽处理可引起肠道菌群的代谢变化和转录重编程
6 肽治疗的抗动脉粥样硬化作用
除此之外，研究者发现，肽处理后，WD小鼠的血浆胆固醇水平和动脉粥样硬化病变显著降低。与对照相比，口服肽1和11分别降低了小鼠血浆总胆固醇37％和36％（图4a）。在CHD喂养的小鼠中，没有类似的肽介导的胆固醇降低。此外，通过快速蛋白质液相色谱法分析血浆脂蛋白组分可知，血浆总胆固醇水平的降低源于肽处理的WD喂养小鼠血浆中极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量的明显降低（图4b）。通过进行粪便双同位素胆固醇吸收测定，证实肽处理不会降低饮食中胆固醇的吸收。主动脉病变区域分析表明，肽1和11分别使动脉粥样硬化病变显著减少了37％和48％（图4d），同时，主动脉窦病变体积分别减少了44％和37％（图4e）。菌群组成分析表明，8种菌群与血浆胆固醇水平呈正相关，5种菌群与血浆胆固醇水平呈负相关（图4c）。肽通常会降低正相关分类单元的丰度，并增加负相关分类单元的丰度（图4c）。
图4 肽治疗减少WD喂养的LDLr-/-小鼠动脉粥样硬化的发展
7 机制对照研究
作者使用了另外两种肽（肽30：c[wMeLwRMeeQeR]和肽15：c[fWwYqHhQ]）作为体内研究的阴性对照，以进一步探查肽治疗，肠道微生物组重塑和观察到的表型变化之间的联系。对照肽30具有与活性肽11相同的氨基酸序列，但其8个主链酰胺基团中的2个是N-甲基化的，从而防止了肽的自组装和抗菌活性。与肽11相反，肽30无法进行环堆叠和亚基间氢键连接，因为它缺少两个酰胺氢键供体位点，并且受N-甲基部分所形成的亚基间位阻。肽30尽管具有与活性肽11相同的氨基酸序列，但由于它无法自组装成纳米管并发挥相似的抗菌活性，因此可作为对照和作用机理探针。对喂食WD的LDLr-/-小鼠口服肽30给药10周。与对照相比，在2周（图4a）或10周的时间点，肽30并未降低总血浆胆固醇水平，在10周时（图10b）也没有降低主动脉窦斑块体积（图4e）。另外的对照肽（肽15）在体外大规模微生物组重塑中测试的所有肽中得分最低（图1）。与对照肽30相似，与媒介物对照相比，肽15在2周的时间点上并未降低血浆总胆固醇水平（图4a）。总之，这些研究表明，缺乏抗菌活性或引起肠道菌群不适当重塑的肽不会带来阳性表型变化。使用广谱抗生素混合物处理小鼠以消耗微生物组，然后进行肽处理，可发现肽11完全丧失了降低血浆胆固醇水平（动脉粥样硬化的关键标记）的能力（图4a），这也表明其通过肽直接靶向和重构肠道菌群以实现调控。
8 微生物组重塑诱导宿主基因表达
RNA-seq分析小鼠肝脏和回肠（小肠）样品（图5a）显示，与CHD喂养组相比，肽11处理可以恢复WD喂养组动物中许多被下调或上调的基因的表达。基因本体分析表明，肽处理后脂质代谢被上调，炎症和免疫相关反应被下调（图5b）。肽处理的WD动物中，胆汁酸生物合成途径中的限速酶Cyp7a1的表达显著增加（图5c），表明饮食中胆固醇向胆汁酸的转化增加是降低血浆低密度脂蛋白胆固醇水平的可能机制。与对照组相比，用肽处理的小鼠粪便中总胆汁酸高两倍，血浆中总胆汁酸低三倍（图5d）。
Cyp7a1的表达受到反馈控制系统的严格控制，其中高水平的饮食胆固醇诱导Cyp7a1的表达，而血浆高浓度的胆汁酸则作为信号分子通过激活法尼酯X受体（FXR）和FGF15/19内分泌轴来抑制Cyp7a1表达和胆汁酸代谢。肠道菌群可以通过胆汁酸代谢和加工来调节肠道中的FXR信号。发现在LDLr-/-背景下缺乏FXR的小鼠在饲喂高脂饮食时具有改善血脂的状况，并能防止饮食引起的肥胖和动脉粥样硬化。与Cyp7a1较高表达一致，观察到在肽处理的动物中FXR及其靶标（包括FGF15）在肠内的表达下调（图5c）。不仅肽介导的肠道菌群重塑改变了胆汁酸池大小，而且还显著影响了粪便和血浆样品中某些胆汁酸的相对组成和丰度。例如，肽处理提高了T-α-β-MCAs（已知的FXR拮抗剂）的水平（图5e），并显著改变了肠道胆汁酸转运蛋白Asbt，Mrp2和Mrp3的表达（图5c）。这些数据表明，FGF15内分泌轴的下调（由于重塑的肠道菌群改变了胆汁酸的加工过程）以及回肠中初级胆汁酸的吸收减少可能是维持肝脏中胆汁酸代谢上调的原因，导致胆固醇向胆汁酸的转化增加，从而有助于降低血浆胆固醇水平。
图5 肽治疗改变了WD喂养的LDLr-/-小鼠的基因表达和胆汁酸组成
9 抗炎和免疫调节作用
炎症在动脉粥样硬化的发展中起关键作用。研究人员发现，肽诱导的肠道微生物组重塑通过几种肠道微生物群依赖的机制减少了由WD引起的炎症。一些共生肠道细菌在维持肠道完整性中起着关键作用。肠道完整性受损会导致肠道菌群衍生的脂多糖泄漏增加，引起加剧动脉粥样硬化发病机制的全身性炎症。通过肽处理上调了与回肠紧密连接相关的几个基因（图6a），并且下调了脂多糖应答途径（图5b），表明由WD引起的肠道完整性缺陷已得到很大缓解。与对照相比，肽处理的动物中回肠的绒毛宽度显著增加（图6b，c）。
作者发现肽诱导的肠道微生物组重塑也影响了肠道中的免疫细胞组成。Helios+胸腺来源的调节性T细胞（tTregs）调节预防失控的炎症反应的关键途径，并在抑制多种小鼠模型动脉粥样硬化的发展中发挥着重要作用。表达GATA3的Helios+ tTregs在组织修复和肠屏障功能中起关键作用。肠道中不同的调节性T细胞（Tregs）的分化和维护是由来自肠道菌群，胃肠道自身抗原和饮食抗原的信号驱动的。通过肽11处理，Foxp3+ Treg群体组成发生显著变化（图6d）。从固有层组织中分离了细胞，并测量了Helios+Foxp3+ Tregs与其他两个T细胞亚群（RORγt+Foxp3+ Tregs和促炎性RORγt+ Th17）的相对布居。肽11处理降低了WD饲喂的LDLr-/-小鼠RORγt+ Th17和RORγt+ Foxp3+ Tregs的绝对数量，但维持了再生Helios+ GATA3+ Tregs的数量（图6d）。由于几种氧甾酮充当天然的内源性RORγt激动剂，因此观察到的促炎性RORγt+ Th17细胞减少可能与肽诱导的肠道菌群重塑导致的氧甾酮和胆汁酸谱改变有关
IL-1β是促炎细胞因子，对IL-6信号通路驱动的炎症反应至关重要。抑制IL-1β可减少小鼠动脉粥样硬化斑块的形成，并显著降低心血管事件的发生率。IL-1α在血管炎症和动脉粥样硬化中也有致病作用。肽11处理的WD动物肝脏组织中几种细胞因子和趋化因子（包括IL-1β-IL-1α-IL-6和TNF-α）水平显著降低（图6e），为肽诱导的WD喂养的肠道微生物组重塑的全身抗炎作用提供了进一步的支持。
图6 肽治疗通过几种肠道菌群依赖性机制减轻了WD诱导的LDLr-/-小鼠炎症
结果
作者设计了一个大规模的体外筛选方案来选择起细菌生长调节剂作用的自组装环状D,L-α-肽，并显示口服施用选定的肽可以有效且有针对性地重塑WD诱导的肠道微生物组，以防止LDLr-/-小鼠动脉粥样硬化的发展。数据表明血浆胆固醇水平的降低是由于重塑的肠道微生物群改变了胆汁酸加工过程，进而下调FGF1内分泌轴，增加Cyp7a1的表达并最终增加胆固醇向胆汁酸的转化。环状D,L-α-肽改善肠道屏障完整性，抑制促炎性细胞因子和趋化因子（包括IL-1β，IL-1α，IL-6和TNF-α）产生，增加肠道Helios+ Treg免疫细胞的相对布居，以及平衡疾病相关代谢物（如SCFAs）的水平。
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