编译：夕夕，编辑：十九、江舜尧。
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导读
大麦（Hordeum vulgare）和水稻（Oryza sativa）都属于禾本科，但耐盐性差异很大。为了解两种物种在耐盐性上差异的分子机制，比较了水稻(Nipponbare)和大麦(XZ26 )两种作物在转录水平上对盐胁迫的响应，揭示了选择性剪切（AS）和转录调控是如何适应盐胁迫反应的。生理实验表明大麦的耐盐性比水稻高。转录组结果分别在大麦的根和茎中鉴定到了606和186个差异表达基因。水稻的根和芽中鉴定到了4667和2817个差异表达基因。选择性剪接分析表明，在大麦的根和芽中有40和33个AS基因。此外，与离子转运蛋白和转录因子有关的AS基因可以增强大麦中K+/Na+的稳定性。目前的研究结果表明，大麦的耐盐性较好主要是K+/Na+的稳定性较好。原名：Transcriptomic and alternative splicing analyses reveal mechanisms of the difference in salt tolerance between barley and rice
译名：转录组和选择性剪接分析揭示了大麦和水稻耐盐性差异的机制
期刊：Environmental and Experimental Botany（2区）通讯作者单位：浙江省农作物种质资源重点实验室，浙江大学DOI号： 10.1016/j.envexpbot.2019.103810大麦（XZ26）和水稻（Nipponbare）的种子使用2%的H2O2消毒30min，蒸馏水冲洗5次，然后在发芽箱中转移到潮湿的滤纸上，随后放入培养室。待植物发芽后，将大麦和水稻幼苗移植到装有水培溶液的15L黑色塑料容器中。所有幼苗均在白天室温26°C（14h）黑天室温20°C（10h）的培养室中培养。每天增加50mM NaCl到水培溶液中，最终NaCl浓度达到100mM，即对大麦和水稻进行盐处理，不添加NaCl的溶液作为对照组。盐处理9天后，取处理组的根部和茎部组织。根部用蒸馏水冲洗数次。每组实验设置三次生物学重复。所有样本80°C烘干3天，随后测重。烘干后的样本采用HNO3和H2O2进行消解。使用ICP-OES测定Na+，K+,Ca2+和Mg2+的浓度。盐处理7天后，取处理组和对照组大豆和水稻的根部组织，液氮速冻。每组处理设置三次生物学重复。使用TRIzol试剂盒提取RNA，使用Rneasy试剂盒进行纯化。使用带有poly-T的磁珠从RNA中富集mRNA，并随机破碎成小块。mRNA合成双链cDNA。cDNA片段通过PCR进行扩增和富集。HiSeq2000进行测序。对raw data进行过滤得到clean data。使用Tophat进行比对。设置FC≥2和FDR＜0.001为差异表达基因筛选标准。使用Blast2GO进行GO和KEGG分析。从GTF文件中提出外显子-外显子和外显子-内含子的连接信息，并基于bam文件和bed文件计算每次连接的次数。过滤标准参考Brooks。为验证转录组结果的准确性，在大麦和水稻的差异表达基因中随机选择20个进行qRT-PCR。每个样本设置两个生物学重复和三个技术重复。之前的研究中，作者比较了分别暴露于100和150 mM NaCl 9天的4种大麦和4种水稻的耐盐性差异，并观察到所有大麦均表现出比水稻更强的耐盐性。 在这项研究中，作者用大麦（XZ26）和水稻（Nipponbare）进行进一步分析。 盐处理后，相对于对照，XZ26的鲜重减少量小于Nipponbare。 在盐胁迫下，XZ26的芽和根的鲜重分别降低了37.2％和48.4％，而Nipponbare则分别降低了54.4％和64.1％（图1A和1B）。盐胁迫下，XZ26的根部Na+浓度是Nipponbare的1.33倍（图1C）。然而，茎中的Na+浓度刚好与根部相反，Nipponbare是XZ26的1.79倍（图1D）。XZ26和Nipponbare的根和芽中K+浓度显著降低（图1E和1F），但XZ26比Nipponbare高很多。此外两个物种之间Ca2+和Mg2+的浓度对盐胁迫表现出相似的反应。这可能表明XZ26比Nipponbare的耐盐性号，主要是由于XZ26的Na离子更易于从根部向茎部转移。
图1 大麦和水稻在盐胁迫下及其对照组的芽和根的鲜重和Na，K浓度基于转录组测序分析，在XZ26的根和茎中分别鉴定到了606个和186个差异表达基因，在Nipponbare的根和茎中分别鉴定到了4667个和2817个差异表达基因（图2）。此外，转录组测序的结果和qRT-PCR结果有显著相关性，其中大麦的相关性为0.88，水稻的相关性为0.94。
在这些差异表达基因中，有一些基因在两个物种中共有，而另一些仅在一个物种中存在（表1）。在根和芽中共鉴定到199和55个常见的差异表达基因。在根部组织中，有两类常见的差异表达基因对XZ26和Nipponbare对盐胁迫的反应表现不同。盐胁迫处理后，class1中的差异表达基因在XZ26中特异上调表达（图3A）。这些差异表达基因一般与过氧化物酶，氧化还原反应酶，转运蛋白和代谢途径有关。其中有10个差异表达基因与过氧化物酶有关，无机磷酸盐转运蛋白和硝酸盐转运蛋白在XZ26中上调表达，而在Nipponbare中下调表达。在Nipponbare中，class2中的基因显著高表达，这些基因与转运蛋白和转录因子有关。
在芽部组织中，有两类常见的差异表达基因对XZ26和Nipponbare对盐胁迫的反应表现不同（图3B）。盐胁迫后，class3中差异表达基因在XZ26中差异表达，其中包括含有铜蛋白结构域的蛋白基因，磷脂酶和磺基转移酶基因，而Nipponbare中特异表达差异表达基因为class4。GO分析结果表明，这些常见的差异表达基因富集到不同的功能中，根部主要富集在氧化应激反应（GO：0006979），金属离子结合（GO：0046872）和膜的整体组成部分（GO：0016021），芽部主要富集在氧化还原过程（GO：0055114），氧化还原酶活性（GO：0016491）和细胞外区域（GO：0005576）。在大麦的根部和芽部中鉴定到了407个和131个特异差异表达基因，在水稻的根部和芽部中共鉴定到了4468个和2762个特异差异表达基因。在大麦的根部组织中上调表达的基因比下调表达的基因多很多，其结果与茎部正好相反。对大麦和水稻中特异表达的差异表达基因进行GO和KEGG分析。在水稻的根部中，共有1030个特异差异表达基因富集到57个KEGG通路，包括代谢通路，次级代谢生物合成通路等。在大麦中，共有27个特异差异表达基因富集到4个KEGG通路。其中，过氧化物酶超家族基因显着上表达（MLOC_78195； 4.77倍和MLOC_49954； 3.28倍），而脯氨酸氧化酶则下表达（MLOC_67213； 0.46倍）。共有物种可变剪接（AS）形式，分别为外显子跳跃（SE）、5'端剪接（A5SS）、3’端剪接（A3SS）、多外显子跳跃（MXE）和内含子滞留（RI）。作者共在大麦和水稻的1310和2791个基因中鉴定到2101和5160个可变剪接事件。作者对两个物种的两个组织中都分析都可变剪接事件（图4A-D）。在大麦的根和茎中RI形式的可变剪接所占比例最高，随后是A3SS，A5SS,SE和MXE（图4A和4C）。在水稻的根和茎中A3SS比例最高，随后是RI,SE,A5SS和MXE（图4B和4D）。盐胁迫情况下，在大麦的根和茎中鉴定到了398和421和AS基因，在水稻种鉴定到了1198和760个AS基因（图5）。
为揭示大麦的独特耐盐性，盐敏感的AS事件主要集中在XZ26中。在盐胁迫条件下，在XZ26的根和茎中共检测到484和507个AS事件，分别涉及398和421个基因（图6A和6B）。然而，大多数AS基因的表达水平没有明显改变（图6）。在XZ26的根和茎分别鉴定到了40和33个AS基因，是与盐胁迫反应有关的差异表达基因（图6）。在根部组织中，AS有关的高表达基因是甲基固醇单加氧酶，L-抗坏血酸过氧化物酶等。而AS有关的低表达基因是结合蛋白基因，LRR受体类激酶等（图6A）。在芽中，ABC转运蛋白家族成员，bZIP转录因子等是高表达的AS差异表达基因，而低表达的差异表达基因是PXM2/4家族蛋白，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等（图6B）。GO分析表明这些基因富集到不同的功能分类。在根部主要的功能有生物合成过程（GO:0009058），催化活性（GO:0003824）等。在茎部主要的功能有蛋白磷酸化（GO_0006468），催化活性（GO:0003824）等。总之，AS差异表达基因主要与盐胁迫下大麦根部和茎部中转录因子和代谢相关酶有关。
在本研究中，作者主要研究了大麦和水稻在生理水平，转录水平上耐盐性的差异。大麦的Na+浓度较低，而K+/Na+的动态平衡更好，因此大麦比水稻的耐盐性更好。在转录组水平上，在盐胁迫下，XZ26的根和茎中分别发现了606和186 DEG，Nipponbare的根和芽中分别发现了4667和2817 DEG。这些差异表达基因主要富集在蛋白激酶、ROS清除和抗氧化作用。在可变剪接水平上，大麦的根和茎中鉴定到了40和33个AS差异表达基因。作者提出，大麦的耐盐性较好可能是由于K+/Na+稳态较好。而基因表达调控和可变剪接事件为揭示大麦的耐盐性较好提供了有价值的信息。
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