一作解读：紫粒小麦中调控花青素合成转录因子的克隆与功能解析
本期作者：蒋文慧
近日，JXB杂志在线刊发了题为“Two Transcription Factors TaPpm1 and TaPpb1 Co-Regulate the Anthocyanin Biosynthesis in Purple Pericarp of Wheat”的研究论文，由西北农林科技大学的王中华教授团队完成，王中华教授和高欣副教授为共同通讯作者，我们特邀请了文章的第一作者蒋文慧来为我们解读这篇文章，以飨读者。
花青素是一类抗氧化物质，紫粒小麦果皮所含有的天然花色苷能清除细胞中自由基，在促进人类身体健康和预防心血管疾病中起重要作用。此外，花青素所引起的紫色表型可作为育种中有效的形态学标记，因此，研究小麦籽粒花青素合成的分子机制具有重要意义。前人研究表明，籽粒花青素合成是由2个基因共同调控的，分别被定位于7D（Pp-D1）与2A染色体（Pp3）上，且推测其分别为MYB与bHLH转录因子(Khlestkina, 2013)。张怀刚研究员及其团队 对2A染色体长臂上的基因TaMYC1（Pp3）进行了克隆，并找到了其变异类型（TaMYC1w与TaMYC1p），基因沉默进一步证明了该基因在紫粒花青素合成中不可或缺的作用(Zong et al.,2017)（介绍一篇发表在Front. Plant Sci. 上有关小麦籽粒颜色研究的论文）。
本研究通过对黑小麦76不同时期及处理的紫色与白色果皮样品进行转录组测序（图1A），进化树分析其转录组中编码MYB与bHLH的蛋白，筛选到了3个与花青素调控相关的MYB基因（TaPpm1、TaPpm2与TaPpm3）和1个bHLH基因（TaPpb1，与TaMYC1为同一个基因）（图1B）。通过与小麦全基因组数据库（Triticum_aestivum.TGACv1）进行比对，将TaPpm1、TaPpm2、TaPpm3和TaPpb1分别定位到7DS、4BL、4DL和2AL上。TaPpm1（7DS）与TaPpb1（2AL）的染色体位置与之前定位的花青素调控位点（Pp-D1与Pp3）相同，且TaPpm1与TaPpb1的时空表达与花青素的积累模式一致（图2），故选择这两个基因作为籽粒花青素调控的候选基因，并对其功能进行了进一步解析。
图1：转录组测序样品及MYB与bHLH的进化树分析
A 用于转录组测序的3份黑小麦76籽粒样品，H-10d与H-17d分别为小麦开花后10 d，17 d的样品，H-10p为花后10 d，去掉颖壳后照光12 h的样品；B. 基于转录组测序结果的MYB与bHLH的进化树分析。
图2：转录因子基因的时空表达模式
A TaPpm1/2/3与TaPpb1在A14与黑小麦76不同组织中的表达；B TaPpm1/2/3与TaPpb1在种子发育不同时期的表达模式。
基因在序列上的变异常引起其功能的改变，因此该研究对紫粒与非紫粒品种中TaPpm1与TaPpb1进行了扩增测序，结果显示，TaPpm1由于编码区存在不同的插入突变，形成4种类型的等位变异（TaPpm1a/b/c/d）（图3A）；而TaPpb1的编码区在不同品种中是相同的，启动子区存在2种等位变异（TaPpb1a与TaPpb1b），其中，TaPpb1a的启动子中存在多个261 bp的重复单元，而TaPpb1b中只存在1个单元（图3B）。供试的四个紫色品种都表现为TaPpm1a与TaPpb1a的基因型，其它突变类型则分布于非紫粒品种中（图3C）。
图3：TaPpm1与TaPpb1序列的等位变异及其在不同材料中的分布
A TaPpm1编码区的四种等位变异；B TaPpb1启动子区的两种变异类型；C TaPpm1与TaPpb1在不同籽粒颜色材料中的基因型分布。
为了检测TaPpm1与TaPpb1的变异是否与紫粒表型存在关联性，将白粒品种A14（TaPpm1d/TaPpb1b）与紫粒品种H76（TaPpm1a/TaPpb1a）进行杂交，统计F2单株的籽粒表型及TaPpm1与TaPpb1的基因型。结果显示，126个F2代单株中，紫粒与白粒的分离比符合9:7，说明籽粒颜色由2个基因共同调控，其中，68个紫粒单株中同时存在TaPpm1a与TaPpb1a基因，而58个白粒单株中，TaPpm1a与TaPpb1a基因不会同时存在（图4A）。
为了进一步探究这两个基因在花青素调控中的作用，采用双荧光素酶试验检测TaPpm1s与TaPpb1对下游花青素结构基因ANS的调控，结果显示，只有在TaPpm1a与TaPpb1共同存在时，ANS启动子能够被激活；TaPpm1a与TaPpb1单独存在或者突变类型TaPpm1b与TaPpb1共同存在均不能激活ANS表达（图4B），说明在调控花青素结构基因表达中，TaPpm1a与TaPpb1缺一不可。
图4：TaPpm1、TaPpb1在F2群体中的基因型分布及其对花青素结构基因的调控
A TaPpm1与TaPpb1在F2群体中的基因型分布；B TaPpm1s与TaPpb1的不同组合对花青素结构基因的调控作用。
前人研究表明，花青素合成往往需要转录因子MYB、bHLH互作进行共同调控(Hichri et al.,2011)。为了探究TaPpm1基因编码区序列的改变对其蛋白功能的影响，利用酵母双杂交试验，检测了TaPpm1的4种变异类型与TaPpb1的互作情况，结果显示，TaPpm1的序列变异直接影响了其编码蛋白与TaPpb1蛋白的互作，即TaPpm1a与TaPpb1的互作强烈，而TaPpm1b与TaPpb1的互作减弱，TaPpm1c/d则不能够与TaPpb1发生互作（图5A）。
为了检测TaPpb1不同启动子作用强弱，将TaPpb1两种类型的启动子分别连接到荧光素酶基因LUC的上游，TaPpb1a的启动子能够启动LUC基因的大量表达，而TaPpb1b则不能（图5B），这说明TaPpb1中启动子区的插入，能够增强TaPpb1的表达，这与苹果花青素调控基因MdMYB10中启动子区插入的重复序列功能相似(Espley et al.,2009)。
图5 TaPpm1s与TaPpb1的互作及TaPpb1启动子的激活功能
A 酵母双杂检测TaPpm1不同变异类型与TaPpb1的互作效应；B TaPpb1两种启动子对下游基因的激活功能
综上所述，本研究结果证明，小麦紫粒的形成受MYB基因TaPpm1与bHLH基因TaPpb1的共同调控。其中，TaPpm1的突变会影响其编码蛋白与TaPpb1的结合，从而使得MYB-bHLH复合体不能产生而阻止花青素的合成，而TaPpb1启动子区的变异直接影响了其基因表达量，在只有一个261 bp单元时，其表达量很低，不能产生足够量TaPpb1，导致MYB-bHLH复合体减少，最终得到无花青素积累的小麦籽粒。本文找到了花青素调控的两个基因，从序列变异的角度解释了这两个基因对花青素合成的影响，开发的标记可用于后续育种中对紫粒性状的选育。
参考文献：
Espley RV, Brendolise C, Chagne D, Kutty-Amma S, Green S, Volz R,Putterill J, Schouten HJ, Gardiner SE, Hellens RP, Allan AC. 2009. Multiplerepeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in redapples. Plant Cell 21, 168-183.
Hichri I,Barrieu F, Bogs J, Kappel C, Delrot S, Lauvergeat V.2011. Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoidbiosynthetic pathway. Journal ofExperimental Botany 62,2465-2483.
KhlestkinaEK. 2013. Genes determining thecoloration of different organs in wheat. RussianJournal of Genetics: Applied Research 3,54-65.
Zong Y, XiX, Li S, Chen W, Zhang B, Liu D, Liu B, Wang D, Zhang H.2017. Allelic variation and transcriptional isoforms of wheat TaMYC1 gene regulatinganthocyanin synthesis in pericarp. Frontiersin Plant Science 8.