线粒体的CRISPR编辑，是有前途的新生物技术吗？
尽管CRISPR / Cas9系统已经在编辑核基因组中得到广泛应用，但是使用它来编辑线粒体基因组仍然存在问题。
主要障碍是在小型mtDNA中缺乏合适的编辑位点，并且传统上难以将指导RNA导入线粒体基质中，在该处可以访问类核苷。
最近发表的两篇论文表明，这两个方面都正在取得重大进展。
第一篇发表在《科学中国 生命科学》杂志上的论文使用CRISPR技术在多个mtDNA微同源区域诱导插入/缺失（InDel）事件。
这些InDel事件是由双链断裂（DSB）损伤特别触发的。
作者发现，通过sgRNA多重化和称为iniparib的DSB修复抑制剂，InDel诱变得到了显着改善，这表明需要重新构建DSB修复机制来操纵mtDNA。
在发表在《分子医学趋势》杂志上的第二篇论文中，研究人员对不同形式的核和线粒体基因组编辑的最新进展进行了全球概述。
为了深入了解其中的一些新发展，我联系了线粒体编辑专家Payam Gammage，该专家在完善基于锌指核酸酶（ZFN）的稍有不同的编辑技术方面具有良好的经验。
这些核酸酶能够靶向双链线粒体以在精确的碱基对位置进行切割，因此可以消除具有错误核苷的异质线粒体。
最近，Payam发现在mtDNA中发现了在癌症中发现的30个最易突变的基因中的25个。
这些突变发生在所有肿瘤中约60％的特定位点，并且至少在结直肠癌中，与wtDNA相比，实际上将患者的寿命延长了大约9年。
超过70％的大肠癌具有至少一种mtDNA，其异质水平高于5％。
尽管核酸酶可以通过选择正确的线粒体来编辑出有害的突变，但是可以编辑新变体的技术可以说是尚不完善的。
虽然以上论文中描述的CRISPR编辑方法听起来很有希望，但Payam涉及三个主要问题，这使他们摆脱了困境。
第一点是，生命科学论文没有完全解决将sgRNA靶向线粒体的问题。
其次，以前在哺乳动物的有丝分裂中已经描述了非常低水平的双链断裂连接。
没有gRNA的高水平表达的Cas9蛋白会导致非特异性双链诱导。
第三，研究人员使用的DSB修复抑制剂可能实际上没有做过传统上认为的事情。
换句话说，尽管曾经认为它可以抑制PARP（聚（ADP-核糖）聚合酶），但后来证明它在不同的途径上起作用。
此外，PARP甚至不局限于线粒体。
哈佛大学和麻省理工学院广泛研究所的David Liu最近发现了一种有趣的新方法，不需要CRISPR技术即可进行精确，无损的线粒体编辑。
即使他经常被称为CRISPR的实际发明者，您也可能不认识他的名字，因为现代进步的诺贝尔委员会的更高权力认为他不符合要求。
Liu的方法依赖于细菌毒素DddA，该毒素催化双链DNA中的胞嘧啶脱氨。
通过添加尿嘧啶糖基化酶抑制剂和TALEN样蛋白，Liu创建了无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中C·G到T·A的转化，具有很高的靶标特异性和产品纯度。
为了进一步探索DdCBE的潜力，Liu的小组成功编辑了五个线粒体基因：MT-ND1，MT-ND2，MT-ND4，MT-ND5和MT-ATP8。
任何想使用这项技术的人都可以访问Liu已上传到Addgene的质粒。
例如，在名为ND4-DdCBE-右侧TALE的位点上有一个ND4构建体，它具有pCMV主链并在哺乳动物细胞中表达。
尽管特定碱基对的完整线粒体编辑远胜于简单地切割mtDNA，但该方法的全面性仍有待观察。
仅当错误位于编辑器可以执行的特定转换范围内时，才可以校正突变体。
利用这种技术确实提出了一个问题，即是否可以创建新的有益形式的线粒体持久性异质性。
例如，有可能引入或产生更好地适应高海拔氧气水平或增强生热作用的体细胞异质线粒体。
无论如何，这些操作不可能被继承。
如果没有，他们将无法进入生殖细胞。
除了三亲胚胎拥护者，人为地引入卵子中的线粒体是人为进行临床研究的最后一个（也是最危险的）地方。
最近发现了一种名为Tuatara的好奇脊椎动物，尽管其序列差异约为10％，但它们仍维持着两个独立的线粒体谱系。
在动物界这是闻所未闻的，除了一些双壳软体动物，已知它们具有明显的雄性和雌性线粒体的双亲遗传。
据报道，Tuataran mtDNA的控制区和复制起点存在重大差异。
研究人员认为，拥有两个不同的mt基因组可能会为异常耐寒的爬行动物提供适应性优势。
在人类中，对于多种神经系统疾病和罕见疾病，线粒体编辑存在着巨大的需求。
例如，自闭症与G8363A转移RNA（Lys）突变有关。最近的其他研究表明，涉及ND6基因错义突变（ND6P25L）的线粒体缺陷导致小鼠具有明确的自闭性内表型。ND6是NADH脱氢酶的一个亚基，它构成呼吸系统复合体I的一部分。尽管众所周知，自闭症在试图确定来自GWAS核研究的致病基因方面充满矛盾，但动物模型中的线粒体编辑可能是更直接的方法，可以更好地定义和最终可以治愈的许多疾病都具有明显的潜在线粒体成分。
More information:
Bang Wang et al. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis at microhomologous regions of human mitochondrial genome, Science China Life Sciences (2021).
DOI: 10.1007/s11427-020-1819-8
Jiameng Dan et al. Expanding the Toolbox and Targets for Gene Editing, Trends in Molecular Medicine (2021). DOI: 10.1016/j.molmed.2020.12.005
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