编译: Yong-qin，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
光是植物生长发育的重要环境因素，植物不同的光感受器可感知不同波长的光，其中光敏色素感知红/红外光。拟南芥基因组编码5种光敏色素蛋白（phyA-phyE），黑暗条件下光敏色素在细胞质合成但不具生物活性，在红光照射下转化为具有生物活性形态并转移至细胞核，以调控光响应基因的表达。光敏色素互作因子PIFs属于bHLH家族转录因子，在光照下光敏色素与核内的PIFs互作诱导其磷酸化、泛素化和26S蛋白酶介导的降解，促进大量靶基因表达。
低温是影响植物生长发育的重要非生物胁迫，而植物已经进化出响应寒冷的调控机制（低温驯化）。低温驯化是通过激活冷调控基因COR获得的，主要编码抗冻蛋白或渗透调节物质生物合成的关键酶。研究表明，AP2/ERF基因家族的冷诱导转录因子CBF/DREB1在低温驯化中发挥重要作用。CBF蛋白可直接结合COR基因启动子并激活表达。
光和温度信号是紧密相关的，通常光伴随高温，而黑暗伴随低温。研究表明光周期和光量可通过光敏色素调节植物耐寒性，其中phyB在环境温度下有热传感器功能，向光素可感知冷信号。PIFs通过直接与启动子结合，在低温下抑制CBF基因的表达，从而使光信号可优化植物耐寒性。研究表明，拟南芥PIF4是介导植物伸长生长和开花的重要调控因子。本研究表明，在环境温度（17-22℃）下CBF1促进拟南芥下胚轴生长，CBF1直接结合PIF4和PIF5启动子并在光照下诱导其表达。此外，CBF1可与phyA和phyB互作，从而抑制其与PIFs互作。
原名：The cold response regulator CBF1 promotes Arabidopsis hypocotyl growth at ambient temperatures
译名：拟南芥冷响应调控基因CBF1在环境温度下促进下胚轴生长
期刊：The EMBO Journal
IF：11.227
发表时间：2020.04
通讯作者：李继刚
通讯作者单位：中国农业大学生物学院
DOI号：10.15252/embj.2019103630
1、CBF1在光照下的表达水平
本研究将CBF1、CBF2、CBF3的突变株和过表达株在光照或黑暗下培养，比较幼苗的下胚轴和子叶生长。结果显示cbf1突变株下胚轴较短，而CBF1过表达株下胚轴较长，且子叶面积显著较大（图1）。
本研究检测了野生型的CBF基因表达水平，结果表明相对于黑暗条件下，光照下的CBF1表达量升高，特别是远红光下（图2A）。为确定光照是否改变CBF1的空间表达，利用CBF1p:GUS株系检测。染色结果表明明暗下CBF均表达于子叶和上胚轴（图2B）。将黑暗下生长的幼苗转移至光照下，CBF1同样显著上调，且远红光和白光的诱导迅速（图2C）。因此，CBF1的表达受光照诱导。
为确定CBF1蛋白积累水平，提取细胞核蛋白质组分，通过CBF1抗体可检测到CBF1蛋白（图2D），且CBF1过表达株与野生型的积累模式相似（图2E）。当黑暗条件下生长的幼苗移植到连续光照下，CBF1蛋白可在10min后检测到（图2F）。在连续光照下，CBF1蛋白持续积累，在转移后的2-3h达到高峰，在24h后则减少（图2G），在连续远红光照射下CBF1也是类似的规律（图2H）。在红光和蓝光下，CBF1的检出较延迟，在转移后12h达到峰值（图2I-J）。这些数据表明，CBF1的转录水平和蛋白积累水平受光照诱导，与光照类型有关。
图1 CBF1在光照条件下促进拟南芥下胚轴伸长。D：黑暗；W：白光；R：红光；FR：远红光；B：蓝光。
图2 CBF1在光照条件下的转录和蛋白水平。A：CBF1在不同光照下的相对表达量；B：CBF1的表达定位；C：从黑暗转移到光照后的CBF1时间表达模式；D：CBF1蛋白在不同光照下的积累水平；E：CBF1过表达株的蛋白积累水平；F-J：CBF1过表达株在光照下的时空蛋白积累水平。
2、CBF1与phyA/B的调控关系
光敏色素phyA/B在植物感知光信号起关键作用。本研究在phy突变体中发现CBF1在红光下的转录水平和蛋白积累水平显著降低，表明phyA/B的调控作用。pull-down分析表明带GST标记的CBF1可与phyA和phyB发生互作（图3A-B）。同时，萤火虫荧光素酶互补成像分析表明phyA和CBF1的共同表达显著增强荧光活性，即CBF1和phyA在植物细胞内可发生互作（图3C）。同时，本研究用免疫共沉淀确定CBF1在远红光照射下的互作蛋白，结果表明在红光条件下CBF1过表达株中CBF1-phyA发生明显共沉淀，这表明CBF1优先与生物活性形式的phyA发生互作（图3D），而CBF1与phyB的互作则不受红光与远红光的影响（图3E）。这些结果表明CBF1与phyA和phyB均发生互作，但对phyA的选择性大于phyB。
图3 CBF1与phyA/B的互作。A-B：pull-down分析；C：萤火虫荧光素酶互补成像分析；D-E：免疫共沉淀分析。
3、CBF1和PIF4/5的调控关系
本研究对cbf1突变株、CBF1过表达株、野生型进行RNA-seq。数据显示突变株和过表达株各有1948和1093个差异表达基因，其中360个基因差异显著。其中，光信号通路的两个关键基因PIF4和PIF5表达差异，而其它关键基因（phyA、phyB、COP1、HY5）并未差异表达。因此，CBF1基因可正向调控PIF4/5的表达，且电泳迁移率分析表明CBF1能结合PIF4/5启动子的特异序列，体内染色质免疫沉淀检测表明CBF1过表达时PIF4/5启动子的CRT/DRE或GCC基序高。度富集。这些结果表明CBF在植物体内与PIF4/5的启动子结合，正向调控其表达。同时，我们用免疫印迹检测PIF4/5的蛋白质含量。结果表明，白光和红光红光照射下，cbf1突变体中PIF4/5蛋白水平明显降低，而黑暗条件下PIF4/5蛋白水平无差异（图4A）。在光照条件下，cbf1+pif4+pif5突变株和pif4+pif5突变株都显著抑制下胚轴伸长（图4B）。这些结果表明PIF4/5与CBF1基因均抑制下胚轴伸长，且PIF4/5是CBF1的下游靶标。有趣的是，35S:PIF4+cbf1株的下胚轴长度明显短于35S:PIF4株，且35S:PIF4+cbf1株的PIF4蛋白水平低于35S:PIF4株（图4C）。这表明CBF1通过其他方式调控PIF4蛋白的丰度。先前研究表明，光敏色素phy在光照下与PIFs互作。因此本研究探究CBF1是否影响phyB与PIF4/5的互作。酵母三杂交数据显示，PIF4/5在红光下与phyB发生互作，而CBF1在酵母细胞共表达时，PIF与phyB的互作显著降低（图5A-B），即CBF1抑制了PIF4/5与phyB的互作。在烟叶中进行荧光素酶互补成像分析显示，PIF4/5与phyB有很强互作，而CBF1的表达使互作显著降低（图5C-D）。pull-down分析显示PIF4/5与phyB共沉淀，而在IP检测中加入越来越多的His-CBF1融合蛋白时，共沉淀含量逐渐减少（图5E-F）。这些结果表明CBF1可以抑制phyB和PIF4/5的互作，从而促进PIF4/5蛋白的积累水平。CBF1基因在低温驯化发挥核心作用。本研究用用cbf1突变株和CBF1过表达株在低温下培养，结果发现17℃时突变株下胚轴伸长抑制（图6A-B）。17/22℃条件下的下胚轴长度比值表明cbf1突变体对温度敏感性增强，而CBF1过表达株对温度敏感性降低（图6C）。这些数据表明CBF1抑制了低温对下胚轴伸长的抑制作用。qPCR数据表明CBF1在17℃时转录水平高于22℃，4℃使最高（图6D）。免疫印迹表明17℃和4℃生长的幼苗中PIF4蛋白水平高于22℃生长的幼苗，但在22℃和17℃时cbf1突变株的PIF4水平相似（图6E），这表明CBF1在17℃时促进PIF4蛋白的积累。CBF1对PIF5蛋白丰度的调控也有类似规律（图6F），因此22/17℃时，CBF1促进PIF4/5的积累和下胚轴伸长，4℃时则不发挥作用，17℃时作用最显著。
图4 CBF1对PIF4/5的正向调控。A：光照下CBF突变株和过表达株的PIF4/5蛋白丰度；B：cbf和pif双突变对下胚轴生长的影响；C：CBF突变株对PIF过表达株的影响。
图5 CBF1抑制phyB-PIF4/5互作。A-B：酵母三杂交验证CBF1、phyB、PIF4/5的相互作用；C-D：荧光素酶互补成像分析CBF1、phyB、PIF4/5在体内的相互作用；E-F：pull-down分析CBF1对phyB-PIF4/5互作的影响。
图6 温度对CBF1调控作用的影响。A-B：不同温度下CBF突变株和过表达株的下胚轴长度；C：17/22℃下胚轴长度比值表明CBF1突变株或过表达株对温度的敏感性；D：不同温度下CBF1基因的相对转录水平；E-F：不同温度下CBF1突变株和过表达株的PIF4/5蛋白丰度。
本研究发现CBF1是植物低温驯化的关键转录因子，它正向调控PIF4/5的表达丰度，同时促进环境温度下下胚轴的伸长（图7）。CBF1在转录水平和翻译后修饰的水平上促进PIF4/5蛋白质积累，光照下phy通过诱导PIF4/5的磷酸化降解，从而抑制下胚轴生长，同时phy诱导CBF1的积累从而促进PIF4/5的积累，防止植物对长时间光照的过度反应。CBF1的光诱导机制有待探索，目前结果表明冷处理或光处理下CBF表达上升后迅速下降，PIF3/4/7可以与CBF基因启动子结合，并在低温时抑制其表达，这表明CBF与PIFs形成一种调控回路，CBF1激活PIFs，而PIFs抑制CBF1。此外，phy是植物热传感器，PIF4是植物热形态建成的调控因子，因此CBF1是否参与植物热响应有待研究。因此，本研究揭示了CBF1在植物下胚轴生长的重要作用，同时为植物光/温度信号通路的复杂联系提供新见解。
图7 CBF1、phyA/B、PIF4/5的调控机制模式图。
光和温度是调节植物生长发育的重要环境因子，但植物的光和温度的信号通路有待探索。本研究在拟南芥上发现AP2/ERF家族转录因子CBF1在环境温度下促进下胚轴伸长。CBF1通过结合PIF基因启动子调控其表达，并抑制其与phyB的互作，且常温下（17-22℃）下作用显著。综上，本研究运用完整的体内和体外互作思路，结合RNA-seq，表明了CBF1的调控机制，为植物的光/温度信号通路提供见解。
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