crispr/cas9系统结构及原理

CRIPSR/Cas9技术是由RNA指导Cas9蛋白进行的定向基因组编辑技术，具有结构简单、安全性高、切点精准、价格低廉、可逆性、可同时编辑多个基因等优点，广泛应用于不同微生物中。这里主要讲一下CRIPSR无痕编辑。通过讲Red同源重组和CRISPR技术结合，可以实现CRIPSR无痕编辑，利用了Red重组酶的高效重组的优点和CRISPR系统识别并切割特异位点的优点。Reisch等（2015）发明了no-SCAR方法，能一步实现多个位点的无痕编辑（包括缺失、点突变、小片段插入等）。该方法需要构建2个质粒，包括受P_TET启动子控制表达的cas9和tetR组成表达的质粒pCas9cr4和由受P_TET启动子控制表达的sgRNA和受阿拉伯糖诱导启动子P_araB控制的λ-Red系统的质粒pKDsg-xxx。Ronda等（2016）基于MAGE（Multiplex Automated Genome Engineering）技术，创造了一种更为高效的CRMAGE（CRISPR/Cas9 and λ Red recombineering based MAGE technology），该方法对3个靶标的重组率高达96.5%-99.7%。

图. no-SCAR系统用于大肠杆菌的基因组编辑（Reisch&Prather 2015）。

图. CRMAGE系统的两个质粒结构（Ronda等 2016）。