10月回顾：将军三箭定天山 不克RAS誓不还
本文始于于11月初，只是两个月连续SITC、ESMO ASIA、ASH、SABCS和ESMO IO，一直拖拖拉拉没有弄，终于这周写完了，所以文中的时态还是11月初。
上周对于KRAS突变的治疗来说真可谓“山中方一日 世上已千年”，在1/3的肿瘤中报道有RAS这个原癌基因家族的突变，过去三十年一系列针对KRAS及其家族成员NRAS、HRAS的研究失败后，随着近期在临床前模型及临床研究中展现的曙光，KRAS可能开始摆脱掉“不可成药”这个标签。
KRAS之所以在以前被认为不可成药，主要是因为其表面比较平滑缺少适合结合小分子抑制剂的疏水口袋。KRAS突变占到了肺癌的13%、结直肠癌的4%，其中正好有一个突变发生的12位，即G12C，这个改变占到了肺癌中KRAS突变的50%，由于Cys的特点，使得这个突变适合被设计靶向的抑制剂。
最早进临床的是AMG510，根据ASCO及后来WCLC、ESMO上更新的数据看，该分子安全性较好，尚未报道死亡事件，960mg剂量被推荐用于后续研究，在该剂量下NSCLC亚组中取得了54%的缓解率、100%的疾病控制率：
而上周在Nature上也发表了AMG510联合其他靶向药物、化疗药物和免疫检查点抑制剂在临床前模型中的抗肿瘤效应得到显著增强：a）体外试验中，与HER2抑制剂afatinib、SHP2抑制剂RMC-4550及MEK抑制剂trametinib联合时产生较强的协同效应抑制肿瘤细胞；b）动物模型中，与信号通路下游的MEK抑制剂联用，显著提高了抗肿瘤效果，可能是通过抑制下游分子较少了旁路效应或者KRAS抑制不安全；c）与化疗联合后相比单独使用显著缩小了肿瘤体积；d-e）与PD-1联合后，绝大多数的联合组的小鼠的肿瘤都有缩小，而且转化为了存活优势，时间明显延长。
相关研究有条不紊的进行：
本次会议上，另一个KRAS G12C抑制剂MRTX849也是姗姗来迟，相关细节可以参考前次推送，这里不再赘述，在RP2D下NSCLC和CRC的缓解率和AMG510都很接近，但是目前样本过小，未来不排除往下掉的可能，当然这是后话；而在poster上，MRTX联合PD-1后大部分老鼠取得了持续、深度的缓解，生存明显延长。KRAS抑制剂+免疫治疗不失为未来在人身上重点探索的一个方案。
除了直接靶向KRAS G12C外，其他的尝试进展如何？我们知道包括KRAS在内的RAS家族蛋白在结合GDP的非活化状态和结合GTP的活化状态之间转换，正常生理状态下，KRAS通常以结合GDP的形式存在，一旦被外界信号刺激，RAS-GDP就会活化化为RAS-GTP，激活包括MAPK、PI3K在内的多条信号通路，这个过程一般由鸟苷酸交换因子（GEF），如SOS1来调控，而反之，从RAS-GTP失活为RAS-GDP的过程一般由neurofibromin 1 (NF1)调节。前文提及的KRAS抑制剂不管是AMG510还是MRTX849都是结合非活化状态的KRAS-GDP，而这带来的一个挑战就是癌细胞可能通过上调上游信号来提高RAS-GTP的丰度，从而产生抵抗。
来自Revolution Medicines的Chris Schulze展示了一种独特的方法来克服其他KRAS G12C抑制剂的限制，他们利用了免疫抑制剂天然产物结合免疫亲和素的特点，设计的小分子抑制剂包含了免疫抑制剂Sanglifehrin A结合免疫亲和素亲环素A(CYPA)的官能团，该小分子同时也可以靶向到活化形式的KRAS-GTP，这时候小分子就能能够招募大量的亲环素A伴侣蛋白结合到KRAS-GTP，引起effector face的空间重排，阻断了BRAF的接近，从而抑制了下游细胞生长和增殖的信号。这些小分子通常结合在CYPA和KRAS(ON)的蛋白互作界面上的诱导口袋，和两个蛋白形成非共价的相互作用。
体外研究发现，其中的RM-010可以抑制KRAS G12C细胞株NCI-H358中下游ERK的磷酸化及增殖，而CYA敲除后，这种抑制消失，说明抑制是依赖CYA实现的。
再做一个实验，就是小分子药物结合KRAS后，如果加入额外的生长因子，能否额外促进KRAS G12C-GTP活化形式的形成？可以看出，结合KRAS G12C(ON，即KRAS G12C-GTP)形式的抑制剂在加入生长因子后对细胞增殖的抑制没有变化，而结合KRAS G12C(OFF，即KRAS G12C-GDP)形式的AMG510和MRTX1257的抑制能力显著下降1个数量级。
在移植小鼠模型中，一系列KRAS G12C(ON)抑制剂的先导化合物单药就能够显著抑制NSCLC和PDAC肿瘤的增长。
不管是细胞实验还是小鼠模型，KRAS G12C(ON)抑制剂联合MEK抑制剂后展示出比单药更强的抗肿瘤效果——可能是MEK抑制后RAS(ON)失去了负反馈调节导致水平升高
而联合SHP2抑制剂后也观察到类似的增强的抗肿瘤活性。
因此Triple Complex平台可能开发出针对活化形式的RAS突变体的特异性抑制剂。
中场休息时间再提下SHP2抑制剂，上个月安郡王府与Revolution Medicines合作，开展AMG510与SHP2抑制剂RMC-4630联合的临床研究，此前Revolution Medicines启动了RMC-4630与MEK抑制剂的联合治疗。
SHP2是由PTPN11基因编码的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，负责催化磷酸酪氨酸的去磷酸化，是多条RTK-RAS-ERK信号通路的共有节点，所以作为致癌基因，SHP2可介导激活RAS-ERK信号通路促进癌细胞的存活和增殖，同时SHP2还介导了MEK等激酶被抑制之后的代偿性激活途径，从而促进肿瘤耐药的发生。SHP2是PD-1信号传导的下游分子，还参与T细胞抑制性信号的传导，不仅抑制T细胞活化而且促进T细胞的失能 ，因此抑制SHP2可恢复或增强T细胞介导的抗肿瘤免疫功能，为anti-PD-1/PD-L1单抗的重要补充。原来SHP2受困于磷酸酶成药性的问题，但是近来通过设计变构抑制剂来稳定SHP2的非活性构象成功克服成药性问题，不断的有新药进入临床，比如RMC4630、RMC4550、TNO155等。
之前发的早期研究结果显示，RMC-4550单独可以延缓肿瘤的生长，同时ERK的磷酸化也呈现出剂量相关的抑制：
这是对KRAS G12C的抑制情况，针对其他的一些突变，比如NF1 LOF，RMC-4550也能延缓肿瘤生长，活化的RAS-GTP形式也显著降低
同时靶向下游的MEK来实现整个通路的抑制，这样：1）实现抑制效果的最大化，一方面可以抑制活化形式的RAS，另外可以在突变的RAS通路外抑制野生型的RAS信号；2）削弱获得性耐药的旁路激活。结合下图的信号通路看，抑制SHP2后同时抑制MEK可以实现抑制效果的最大化:
下面就是两个联合的例子：1）在NF1 S1759C这个LOF模型中，靶向SHP2合MEK抑制剂后肿瘤生长相比单药显著延缓，同时小鼠生存期也明显延长；2）在KRAS野生型但是发生扩增的模型中，这时候G12C抑制剂就无法起效，而将SHP2和MEK同时抑制后肿瘤生长不仅延迟，还明显的缩小。
后续的研究已经开展，只是用的是另一个小分子抑制剂RMC-4630，和Sanofi全球合作，开始了联合MEK抑制剂的治疗已经完成首例患者给药。
由于不管是突变的还是野生型的KRAS结合GTP都依赖于SOS1，所以研究人员假定选择性的抑制SOS1之后，不管KRAS突变与否，都能阻止SOS1与KRAS的相互作用最终抑制KRAS。本次大会期间BI介绍了SOS1抑制剂BI-3406，能够强效特异性的阻断SOS1::KRAS-GDP的相互作用，这种抑制是nM级别的；和KRAS G12C抑制剂ARS-1620只能抑制G12C突变相比，BI-3406还能阻断SOS1与KRAS G12D的相互作用，说明3406的抑制是不依赖KRAS突变类型的。
此外不仅仅是G12位，包括G13位的多种KRAS突变的细胞株都对BI-3406敏感：下游通路中ERK的磷酸化和细胞增殖能力都得到了有效抑制
在KRAS G12C突变的胰腺癌模型中，BI-3406单药按12.5mpk和50mpk BID两个剂量处理都能延迟肿瘤的增长，耐受性也很好；在信号通路的调控上可以看出，相比空白对照，接受BI-3406处理后4和10hr，都观察到下游一些靶基因表达的下调，但是在第24hr时候恢复到抑制前的基线状态，这个时候就要同时抑制RAS的下游靶点，比如MEK来增强抗肿瘤活性。
KRAS突变的肿瘤中MAPK通路活化程度更高，所以对MEK抑制剂相比KRAS野生型的肿瘤更敏感；但是MEK抑制后会引起获得性的耐药，可能上调RTKs表达，提高RAS-GTP的丰度，所以此时期待联用BI-3406可能来克服这个问题。
双靶点联合后比单靶点更加有效的延缓了肿瘤的增长，也只有双靶点抑制后观察到肿瘤大小的缩小，另外即便停药后也观察到了这种疗效的持续。
在其他类型的KRAS突变肿瘤模型中也观察到同时靶向SOS1和MEK后对肿瘤增长的抑制
上述结果得到了进一步验证：同时SOS1和MEK在KRAS G12C CRC PDX模型中依旧具备抗肿瘤活性，而且不仅MAPK通路，PI3K通路同样也被阻断。
基于上述结果，BI进一步优化得到BI 170193并启动其单药或联合Teametinib针对晚期特别是KRAS突变实体瘤的Ph1临床。
另一个值得关注的nM级SOS1抑制剂是鳌拜开发的BAY-293，目前在体外研究中证明BAY293能较强的抑制RAS激活(A)和pERK水平(B)，并且这种KRAS野生型的细胞株中pERK水平的降低与SOS1::RAS相互作用的抑制呈现相关性(C)；而(D)显示在KRAS G12C的细胞中，BAY-293对pERK抑制强度弱于KRAS直接抑制剂——这也可以解释间接抑制剂无法完全抑制下有信号，必须联合治疗的原因，两者联合后的协同效应也在图(E)得到验证，其他更进一步的结果较少：
上述是本次Triples关于KRAS实体瘤的主要研究的回顾，AACR官方网站评论如下：
With many more KRAS inhibitors currently being developed in addition to those described above, the field of targeting RAS has undoubtedly gone from being quiet to explosive, and this is a testament to the fast pace of research and technological advancements. However, researchers working in this space are cognizant of the likely scenario where patients develop resistance to these therapeutics. While the combinatorial treatment approaches proposed above could mitigate some of the challenges with drug resistance, it remains to be seen what impact this class of therapeutics will ultimately have on cancer patients with unmet treatment needs.
总体上看这个领域未来一定是联合的天下，不管是因为提高单药疗效，还是克服耐药，当然更现实的是KRAS G12C以外的突变估计很难设计直接靶向抑制药物，当然可能会催生基于PROTAC、ASO或RNAi平台的药物来克服小分子药物的不足。
最后一个问题，除了上述靶向药之外，KRAS突变的肿瘤有没有其他的生物学机制可以用来设计药物呢？
先看最近KN-042中KRAS突变与疗效的相关性分析，发现KRASm NSCLC中PD-L1表达和TMB高于野生型患者；而KRASm构成上也主要是高PD-L1 and/or TMB：
这部分本身是anti PD-1单药治疗的优势群体：KRASm患者有着更长的OS、PFS及更高的ORR，尽管这个分析有局限性，但是提示PD-1单药联合一个靶向药的无化疗方案在KRASm NSCLC中的可行性。
安王府在Q3就开始入组AMG510联合anti-PD-1治疗KRAS G12C的NSCLC的探索临床，临床前的模型中有明显的协同（图上文也有）：
上文提及：SHP2作为致癌基因，除了介导激活RAS-ERK信号通路促进癌细胞的存活和增殖外，还作为PD-1受体的下游分子，参与T细胞抑制性信号的传导，不仅抑制T细胞活化而且促进T细胞的失能。之前有研究表明SHP2变构抑制剂SHP099可通过恢复或增强CD8+细胞毒性T细胞介导的抗肿瘤免疫：
与此同时，SHP099与anti-PD-1单抗联用，阻断T细胞抑制性信号的两个不同环节，在治疗小鼠结肠癌中具有明显的协同作用。
需要指出的是，该研究中用的CT26结直肠癌细胞是KRAS WT细胞，但是考虑到SHP2抑制剂本身对KRAS突变的肿瘤也有抑制，这个组合还是值得进一步关注。
其他基于PD-1/-L1的联合治疗方案用于RAS突变的肿瘤的临床还包括联合MEKi这种最不要动脑子的方案，有兴趣的可以自行八卦：
NCT03637491：binimetinib + avelumab ± talazoparib
NCT03225664：trametinib + pembrolizumab
另一个方向就是自吞噬，研究发现在RAS突变的胰腺癌中抑制RAS→RAF→MEK→ERK信号通路中的相应信号分子后，肿瘤细胞的能量代谢和线粒体功能均受到抑制，肿瘤细胞的自噬明显增强。由于自噬过程分解代谢的产物能够为维持肿瘤的正常代谢提供必要的营养物质，因此靶向该信号通路的治疗方法并不能明显的抑制肿瘤细胞的生长。而自噬抑制剂羟氯喹与MEK或ERK抑制剂联合应用后在体外研究、临床前动物模型以及临床试验中均能有效抑制肿瘤的生长。这一发现也为KRAS基因突变的胰腺癌患者提供了新的联合用药方案。
目前针对自噬开发的药物主要集中在ULK、VPS34和溶酶体抑制：
可以阅读：五分钟读懂自噬信号通路
ULK蛋白激酶是自噬启动和进展的重要调控因子，连接上游营养或能量感受器 mTOR 和 AMPK 与下游自噬体形成的桥梁，在饥饿信号下被AMPK激活，而在营养充足的情况下被mTOR介导失活，而针对ULK设计的抑制剂DCC-3116旨在通过抑制ULK1对其底物Atg13的磷酸化来阻止自噬信号的启动，同时抑制MAPK信号通路中的下游效应蛋白，使得肿瘤细胞无法产生维持增殖所需的营养而死亡。
DC-3116在多个RAS突变的肿瘤细胞株中能强效的抑制ULK的活性，这种抑制强度与MEK抑制剂的浓度提升保持一致
进一步的体外实验证明，在KRAS突变肿瘤细胞株中DC-3111能够进一步抑制自噬体的形成和溶酶体降解
而KRAS突变的PK/PD模型显示，随着时间的延长，DCC3116能够持续强效的抑制ULK
下面就是体内实验，不管是KRAS突变的肺癌还是胰腺癌模型中，只要DCC-3116联合MEK抑制剂，比任何一个单药都能明显的延缓肿瘤的生长
DCC-3116不管是和已经上市的2款MEK抑制剂联合，还是和研发阶段的ERK抑制剂联合，在RAS突变的动物模型中都呈现出明显的协同增效
所以又多了一条路。
【待续】