编译：怀瑾，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
转录组分析是研究肝功能，肝病过程中基因表达变化，鉴定预后标志或特征以及发现新治疗靶标的重要方法。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学可以研究单细胞或空间水平的转录活性，ScRNA-seq为发现正常和患病肝脏中未知的细胞类型和亚型，研究肝祖细胞等稀有细胞以及非实质细胞在慢性肝病和癌症中的功能开辟新的方向。空间转录组学将空间信息添加到scRNA-seq数据中，转变了对组织功能结构和天然环境中细胞间相互作用的理解。本综述简要回顾scRNA-seq和空间转录组学的原理和技术，重点介绍这些方法在肝脏生理和疾病中的最新发现和见解。
原名：Single-cell genomics and spatial transcriptomics: discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology
译名：单细胞基因组和空间转录：新发现的细胞状态和肝脏生理和疾病生物学细胞相互作用
期刊：Journal of Hepatology
IF：18.946
发表时间：2020.6
通讯作者：Neil C. Henderson, Thomas F Baumert
通讯作者单位：英国爱丁堡大学，炎症研究中心；法国斯特拉斯堡大学，病毒和肝病研究所
DOI号：10.1016/j.jhep.2020.06.004
1.单细胞基因组和空间转录技术原理
测序技术越来越多地用于研究肝病的表型和驱动因素。组织RNA测序主要用于鉴定正常和患病条件之间基因表达的主要差异，因其提供样品RNA含量的平均读数，无法用于研究特定细胞类群。在免疫治疗和精准医疗时代，需要更高分辨率的测序数据来表征异质组织和复杂疾病。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术使单个细胞内的全基因组RNA分析成为可能。在scRNA-seq中，肝脏组织被解离，单细胞被捕获，使用多个工作流程执行RNA测序（图1、2）。ScRNA-seq可以生成包含单细胞成千上万个基因转录本的超大数据集，这些数据在压缩的2D空间中表示，根据细胞的相似性对它们进行聚类，并且可以在不同的t-SNE图上绘制单个或多个基因（图1A）。此外，算机谱系追踪可分析细胞类型或细胞亚型之间的发育轨迹（图1B）。最近开发了新的技术算法可使用空间组织的RNA捕获探针对组织切片进行scRNA-seq。
图1. 单细胞RNA测序分析可研究肝脏病理生理
scRNA-seq实验的初始步骤涉及组织解离和单个细胞的分离，这可以通过多种方法获得（如图2）。单细胞捕获方法的选择很大程度上取决于细胞类型，组织中的分布以及成本。之后经细胞裂解、逆转录成互补DNA（cDNA）、第二链合成以及cDNA扩增等步骤生成scRNA-seq文库。这些步骤在不同的scRNA-seq方案中有所不同（图2）。Smart-Seq2利用模板交换技术逆转录，并进行PCR扩增，从而实现对转录本的全长测序、研究剪接活动和等位基因特异性表达。Smart-Seq2成本高昂，但目前已开发出各种方法在保证足够RNA覆盖率的同时降低成本。这些方法包括捕获RNA poly（A）尾以及在cDNA插入随机独特的分子标识符（UMI）和预先指定的细胞条形码（图2）。两种或多种scRNA-seq技术的组合，例如基于微滴的系统和Smart-Seq2协同，可以增加捕获稀有细胞类型和低丰度转录本的可能性。总之，ScRNA-seq包含多种技术，应根据研究设计和所需的终点（例如研究稀有细胞类型或低表达基因或剪接变体分析）和成本选择合适的技术或技术组合。但目前技术还未完全成熟，通常需要在成本和基因覆盖率之间折衷。计算机算法，直接的空间转录组学以及scRNA-seq和空间技术的结合，使人们能够研究复杂且高度空间化组织中的单细胞基因表达。
图2. scRNA-seq主要步骤以及常用方法的比较
2.单细胞水平的肝脏生理特征研究
scRNA-seq的最早应用之一是在小鼠和人类中进行肝脏分区的研究。目前已经开发了特定的测序策略和生物信息学分析，使人们对肝脏分区有了新的认识（图3）。Halpern等人将scRNA-seq与单分子RNA荧光原位杂交结合（smRNA-FISH）研究小鼠的肝区，实现空间分辨的RNA测序。小鼠肝脏的空间分辨scRNA-seq数据发现，（1）肝区带的主要决定因素不仅是氧梯度和WNT信号，还有激活门静脉基因的RAS信号和抑制门静脉基因的垂体信号（图3B）；（2）分区并不总是单调的，有些基因如Hamp（编码铁调素）在小叶中层表达最高（图3A）；（3）编码胆汁酸代谢酶的基因沿门-中轴表达不同，表明整个代谢过程的空间分区。（4）在周缘区域产生的代谢物被周缘肝细胞摄取，这一过程称为空间循环。在空间转录数据基础上，配对细胞测序是研究细胞类型分区的绝妙方法。Halpern等人对肝细胞和肝窦内皮细胞（LSEC）的双重序列测序，结果表明LSECs基因呈带化分布。并且中心的LSECs富含WNT信号基因和调节因子，提示LSECs可能会影响肝细胞的分区。当表面蛋白可用作空间标记时，空间分选是一种使用FACS从特定区域分选细胞的方法。组合两个或多个反向分区的标记可以对特定肝小叶区域的细胞进行分选，这有助于scRNA-seq和多组学分析。质谱分析蛋白质组学和空间分选的肝细胞RNA-seq可以绘制蛋白质分区图谱，以及特定肝脏区域中基因与蛋白质表达的相关性。对空间分选的小鼠肝脏进行大量microRNA（miRNA）微阵列分析，发现miRNA沿着门-中轴分区。通过空间分类对小鼠miRNA分区的研究表明它们与WNT相关基因呈负相关，提示miRNA在确定肝细胞分区中的潜在作用。当空间结构是组织异质性的主要因素时，计算分析可从scRNA-seq数据帮助推断空间信息。Aizarani等人利用扩散拟时间分析对人类健康肝脏的肝细胞和LSEC的带状分区进行建模。这项计算分析（1）首次在单基因水平上分析人肝细胞和LSEC的门-中心区带，（2）发现LSEC基因高度带状分布，（3）证明肝细胞和LSEC具有非单调带状分布的基因。超过60％的LSECs基因已被证明呈带状分区：周围的LSECs富含激素信号传导和代谢相关基因，而中部LSECs富含涉及血小板活化，免疫调节和清道夫功能的基因。有趣的是，清除剂和血小板激活基因也富集在中部肝细胞中，表明肝细胞和LSEC存在功能上的共带状分区（图3C,D）。最近已经开发出了更复杂的算法从scRNA-seq数据中获取空间信息。NovoSpaRc是一个计算框架，可以在不使用已知空间信息和标记基因的情况下对单细胞基因表达进行从头空间重构。但novoSpaRc尚未用于研究肝脏的空间结构和功能。
图3.肝脏分区的新概念（基于scRNA-seq研究）
从标准scRNA-seq数据推断空间信息的挑战之一是需要通过直接的空间技术（如免疫组化，免疫荧光或FISH）进行后续验证。为了克服这个问题，最近开发了允许原位空间转录组学研究的系统。这些系统通常由一个特殊的载玻片（覆盖携带寡核苷酸的串珠，用于RNA捕获），确定串珠位置的空间条形码，用于转录物计数的UMI，用于cDNA合成、扩增和测序的启动子和衔接子以及从玻片上分离寡核苷酸的切割位点等组成（图4A）。切割冷冻的肝组织，放置在空间转录组玻片上，进行H＆E染色，并用常规显微玻片扫描仪扫描。组织裂解释放的RNA被寡核苷酸捕获，之后寡核苷酸被裂解，以此制备的文库用于scRNA-seq。测序完成后，将H＆E图像与标有空间条形码的串珠的坐标结合，生成单细胞空间转录组数据（图4B）。这些技术已成功用于研究复杂的组织，如脑或乳腺癌，并为肝病的细致研究提供广阔的前景。
图4. 原位空间转录组模型
3.利用SCRNA-SEQ鉴定肝发育和再生相关的祖细胞
再生是肝脏生理学的关键特征之一，但肝胆前体细胞的确切身份和异质性程度尚未明确。ScRNA-seq最近已用于研究胎儿和成年肝脏中肝胆前体细胞的异质性和信号通路。对人胎儿肝脏的单细胞分析已鉴定出一种独特的肝胆杂合祖细胞（HHyP），能够定向发育为肝细胞或胆管上皮细胞。Aizarani及其同事利用scRNA-seq分析了健康人肝中EPCAM+细胞的异质性，以了解成年肝是否具有HHyP类似的细胞类型。观察到EPCAM +区室中存在相当多的异质性，包含一个EPCAM + TROP2intCK19low祖细胞，具有形成双能类器官的潜能，并可定向分化为肝细胞或胆管细胞。这种以前未知的成年肝祖细胞位于Hering管中，相当于胎儿HHyP和小鼠中的卵圆形细胞。在正常肝脏中，祖细胞通常是静止的，肝损伤后其定向和激活的潜在机制仍不清楚。在动物模型中，肝损伤可以通过多种模拟不同肝脏病理的方法以可复制的方式诱发。ScRNA-seq已成功应用于肝损伤的小鼠模型，研究肝再生的驱动力，并揭示了YAP靶基因是EPCAM +区室异质性的主要来源。该基因在肝损伤过程中被上调，促进并维持祖细胞增殖和肝再生。为了准确地表征人类疾病中肝脏再生的驱动力，需要进一步集中分析在慢性和急性损伤后人类肝脏的祖细胞亚群。
4.慢性肝病和肿瘤微环境的新见解
4.1 慢性肝病和肝硬化中非实质细胞的表型
利用两种互补的测序技术mCEL-Seq2和10X Chromium得到的两种人肝脏单细胞图谱，加深了对正常肝脏组成的细致了解，也为基于单细胞的肝脏疾病研究提供参考。肝脏微环境（包括肝细胞和非实质细胞（NPC））在所有慢性肝病的发病机理中都起着关键作用。为应对慢性肝细胞损伤，免疫细胞产生促炎性细胞因子和趋化因子，静息态的肝星状细胞（HSC）激活成肌纤维母细胞，后者有助于胶原蛋白和细胞外基质的积累（这是肝纤维化的标志）。单细胞研究已经被用于解决NPC在慢性肝病和肝硬化中的异质性和复杂的细胞间相互作用。
肝内皮细胞参与多种细胞间相互作用以及循环性单核细胞向肝巨噬细胞的初次分化。在健康和饮食诱导的NASH淀粉样蛋白（AMLN）小鼠模型中，单细胞研究应用于表征NPC分泌蛋白组和细胞间相互作用。发现LSEC能够分泌血管分泌因子，并表达参与细胞间相互作用的几种基因。其配体表达于胆管细胞、HSC和LSEC，提示与其他NPC的相互作用以及自分泌信号传导。在NASH肝脏中，LSECs上调与脂质代谢，趋化因子释放和抗原呈递相关基因的表达，而与血管稳态和血管发育有关的基因则被下调，从而引起血窦毛细血管的显著破坏。
LSECs是肝小叶中单核细胞和其他骨髓衍生细胞的入口。LSEC与单核细胞的相互作用对于决定循环性单核细胞的命运及其分化为肝巨噬细胞至关重要。肝库普弗细胞（KC）耗竭的小鼠，其肝脏会被KC样的循环性单核细胞快速填充。LSECs表达DLL4和TGFβ1，分别与单核细胞的NOTCH和TGFβ/ BMP受体相互作用，从而下调单核细胞特异性基因。对小鼠模型的单细胞分析表明，单核细胞衍生的巨噬细胞在NASH肝脏中具有独特的炎症表型。在NASH发病机制中，LSEC与单核细胞的相互作用需要进一步研究。肝星状细胞（HSC）在空间和功能上分区，并且是自分泌和旁分泌信号的枢纽。利用scRNA-seq对健康和纤维化小鼠肝脏中的肝间充质解卷积分析，揭示了整个肝小叶中HSC的空间分区和功能分区。空间上分为门静脉相关HSC（PaHSC）和中央静脉相关HSC（CaHSC）。功能上，CaHSCs代表CCl4诱导的（小叶性纤维化小鼠模型中）致病性胶原蛋白的产生细胞，LPAR1（溶血磷脂酸受体1）可作为其治疗靶标。来自小鼠肝脏的ScRNA-seq还显示，HSC可特异性分泌细胞因子作用于LSEC，巨噬细胞和胆管细胞，从而调节纤维化、细胞因子表达、血管活性激素信号和HSC凋亡。对HSC基因表达的分析还揭示了其潜在的肝外调节能力。HSCs表达血管活性激素反应性受体，特异性介导降钙素基因相关肽的产生（如PTH和VIP，在任何肝细胞类型均不表达）。从肝纤维化发病机理的传统观点来看，HSC是NPC激活级联反应的最终效应器和最后一步。对NASH中HSCs的单细胞分析表明，其上调Il11和细胞因子，并调节LSECs和巨噬细胞的功能，提示更为复杂的双向相互作用。总之，HSC的单细胞分析进一步扩充了对其作为肝（正常和患病肝脏）NPC旁分泌/自分泌网络中心枢纽的理解。
4.2 在纤维性龛中巨噬细胞表型及与非实质细胞的相互作用
在体内稳态下，肝脏不断暴露于肠道产生的病原体和毒素中，并清除大量微生物及相关分子，以维持耐受和免疫抑制的环境。人类肝脏单细胞图谱表明，正常肝脏不仅含有发挥代谢和清除功能的免疫调节巨噬细胞，还有促炎性巨噬细胞。在NASH小鼠模型中，scRNA-seq结果表明此小鼠模型体内存在促炎性巨噬细胞的扩增。NASH中的巨噬细胞表达高水平的Trem2（编码先天免疫清道夫受体）。肝Trem2high巨噬细胞富含与抗原呈递、ECM重塑、内吞作用和溶酶体降解有关的基因，提示在NASH发病机制中起重要作用。Trem2high巨噬细胞还过表达Cd9，参与许多细胞过程（包括细胞分化、粘附和信号转导、并阻止巨噬细胞融合成多核巨细胞）。此外，这种NASH相关的巨噬细胞表达Gpnmb（编码负性调节炎症的一类跨膜糖蛋白）。Trem2high巨噬细胞占NASH肝脏中KCs的60％以上，而对照组小鼠几乎检测不到。Ramachandran及其同事对健康和肝硬化的人类肝脏进行scRNA-seq，并研究纤维化相关NPCs的异质性。在肝硬化组织中普遍存在特定的巨噬细胞亚群，被标记为与疤痕相关的巨噬细胞（SAMΦ）。SAMΦ以表达TREM2和CD9为标志，并能够激活HSCs。单细胞水平的自我组织图谱和拟时间分析表明，SAMΦ来源于血液单核细胞。向SAMΦ的分化过程涉及与抗原加工和呈递、吞噬作用、趋化因子、血管生成、细胞外基质产生和伤口愈合有关基因的表达。在NAFLD早期和CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中均存在SAMΦ。这些数据表明TREM2+SAMΦ是单核细胞来源的巨噬细胞，代表了对慢性肝损伤的保守性固有反应，进而促进间充质细胞的活化和纤维化。目前正探索操纵这类巨噬细胞亚群的方法以获得治疗靶点，并且需要功能相关的数据以充分理解这类细胞在慢性肝病的不同病因中的作用。ScRNA-seq分析不仅鉴定了SAMΦ，还鉴定了PDGFRα+间充质细胞和两个以前未知的瘢痕相关内皮细胞亚群。运用单细胞数据，多谱系配-受体相互作用和多重免疫荧光分析，表征了SAMΦ，SAEndo和SAMes之间的多向相互作用（图5）。细胞间的配-受体相互作用多谱系模型揭示了TNFRSF12A，PDGFR和NOTCH信号传导在内的多种促纤维化途径的瘢痕活性。
图5. 人肝纤维性龛中细胞间配体和受体的相互作用
总之，scRNA-seq发现了位于人肝纤维化的纤维性龛中，瘢痕相关的巨噬细胞，内皮细胞和间充质细胞亚群，并揭示了这些不同细胞类型如何相互作用以促进纤维化。肝硬化中的纤维增生是一个高度复杂的过程，处于不同分化和激活状态的多种不同细胞谱系间相互作用。新型抗纤维化疗法的开发需要考虑人类肝脏纤维性龛的复杂性，同时调节多个治疗靶标以实现效能。
5. 阐述原发性肝癌中肿瘤微环境和异质性
Aizarani等人表明以正常人类细胞图谱为参考，肝细胞癌（HCC）单细胞分析可用于表征HCC中扰乱的细胞状态。他们发现（1）癌症上皮细胞上调促炎性基因（WNT和Hedgehog）；（2）HCC中的内皮细胞失去经典的窦状腺标记，并显示出典型的大血管内皮细胞标记，这与表征HCC发育的动脉化过程一致；（3） HCC内皮细胞和巨噬细胞均下调先天性免疫信号并上调受体酪氨酸激酶信号通路，这也是目前批准的HCC全身治疗的靶点。有趣的是，HCC内皮细胞高表达CD34和PLVAP，如同SAEndo中所观察到的，这些表明纤维化和癌症相关的内皮细胞具有潜在的共同变化。ScRNA-seq分析还为HCC免疫细胞微环境的复杂性提供了新见解。Zheng等人在单细胞水平上研究HCC患者血液，肿瘤未浸润的肝区和肿瘤组织中的T细胞组成。发现具有免疫抑制功能的T调节细胞（Tregs）和衰竭的CD8+ T细胞（Tex）被克隆性富集，后者预计通过CD8+ GZMK+ T细胞亚型起源于细胞毒性CD8 +T细胞。与C型凝集素同源的跨膜蛋白LAYN被鉴定为T细胞衰竭的新标志物，其在HCC中的表达对应肿瘤的高复发率。Zhang及其同事将Smart-Seq2和10X Chromium方法相结合，对来自肿瘤，淋巴结（LN）和腹水的CD45+免疫细胞进行了scRNA-seq，以表征HCC中的巨噬细胞和树突状细胞（DC）。LAMP3是炎症刺激后成熟DC表达的特异性糖蛋白，在HCC和LNs中均观察到了成熟的LAMP3+ DC，这些细胞被预测通过IL-15和PD-1 / PD-L1与T细胞和NK细胞相互作用，并且与T细胞功能障碍密切相关。肝癌中的巨噬细胞被证实具有两种不同的状态，一些巨噬细胞类似于髓样来源的抑制细胞，具有强大的免疫抑制表型，可调节其他免疫细胞的功能；第二个巨噬细胞类似于肿瘤相关巨噬细胞（TAM），具有促炎-免疫抑制混合表型。肝癌中影响肿瘤微环境（TME）的因素仍然未知。最近，单细胞分析被用来探索肿瘤内异质性（ITH）和TME之间的相互关系。HCC和肝内胆管癌的数据表明，ITH较高的肿瘤具有更高的免疫抑制性TME，缺氧相关的基因较多，VEGF表达较高且患者生存率较低。癌症上皮细胞缺氧和VEG的分泌似乎是异源性癌症中驱动ITH和TME变化的主要机制，为原发性肝癌治疗的抗VEGF和抗血管生成药物提供了额外的理论支持。
6. 挑战与前景
尽管scRNA-seq和相关的尖端计算分析推动了对复杂器官和组织的研究，为肝脏领域的未来发现提供广阔前景，但面临一些挑战。解离过程可引起转录组的变化，因此应仔细优化以获得最大的解离量而不会引起偏倚。此外，scRNA-seq价格昂贵，单细胞数据分析费时且需要娴熟的生物信息学技术支持。直接的空间转录组技术可以潜在克服其中一些问题，但是它们在肝脏相关研究中的灵敏度和有效性仍待明确。技术正朝着多组学单细胞方向迈进，这将允许我们在同一细胞中表征蛋白质组学、基因表达和DNA突变，也将使我们在单细胞水平更加全面地了解肝脏生理和疾病。未来，我们努力降低技术成本的同时，还要鉴定组织学或放射学替代标志物，以助于肝脏疾病的表征和分级，这样一来也有利于预测药物反应或患者预后。ScRNA-seq是一项革命性的技术，以前所未有的分辨率成功应用于健康和患病肝脏的研究，捕获细胞类型和状态的异质性并表征细胞间相互作用。在理解肝脏分区、再生以及慢性肝病和癌症的生物学方面提供了革命性的新发现。现在的挑战是如何充分利用这些新知识并将其转化为有效的新型治疗方法，以应对领域的临床挑战。
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