普通口服固体参比制剂解析的心得体会
参比制剂的解析工作，目前讨论火热的反向工程是参比制剂解析的重要环节，已经有众多高手解读，笔者亦十分赞同朱海建博士分享的报告——《反向工程的价值与手段》，指出了反向工程研究范围与手段，也提供了很好的解析案例，值得制剂研发人员深入学习思考。
笔者在制剂研发过程中，也在思考适合我们国内企业特点的参比制剂解析手段，在有限的检测仪器上达到基本解析参比制剂的目的，还曾在丁香园论坛上组织过线下参比制剂解析讨论（http://www.dxy.cn/bbs/topic/35507588），主要是针对解析技巧而讨论，有兴趣的朋友可以去看看。
然而，解析技巧仅仅是“术”，而非“道”，如能理解参比制剂解析之“道”，则各类制剂类型拿到手里，都有底气去仿制成功。当然，在底气培养的过程中，尝试、观察、思考、总结仍然是修“道”之路；而勤奋是上路之靴，所有的感悟都离不开勤奋二字。
参比制剂解析研究包括文献调研与解读以及参比制剂实验分析两个主要模块。
文献调研是为了了解参比制剂的来龙去脉，主要关注药物基本理化性质、体内吸收情况、处方工艺信息等，在整体上把握参比制剂需要研究的内容-尤其是溶出曲线，为研究工作提供评估依据。在如今一致性评价的背景下，BE价格高企，如何通过体外研究评估，降低BE风险是每一家药企都密切关注的。
参比制剂实验分析主要是为了弄清参比制剂的理化性质，以片剂为例：形状、硬度、厚度、API晶型与晶形、API粒径、水分、有关物质、包衣增重、各处方辅料用量、不同介质下的溶出曲线，并根据处方辅料组成或型号以及溶出现象推测参比制剂的制备工艺；以及影响因素和加速条件下参比制剂的溶出、有关物质变化趋势等；为仿制药的开发提供指导方向，并通过数据对比证明仿制药与原研制剂的药学一致性。
一、文献调研与解读
工欲善其事必先利其器，参比制剂的文献调研工作即是仿制药研发之器，各论坛和微信已经有众多分享，如今网络发达，如何查找信息已经不再是秘密，笔者不再赘述。
而对于目前一致性评价的289个项目，我们更应去检索日本药监局PMDA，获取更多的溶出曲线与体内药动学信息。找到了众多信息，如认为了解了参比制剂的处方组成、制剂专利、原料药的一般理化性质、基本的药代动力学参数，就已经完成了文献调研，还不能算是合格的制剂研发。如何解析所获信息用于指导开发和BE评估才是关键，也是制剂研发人员的必修课。
一般而言，我们通过信息收集，如FDA公开的信息，查看说明书label、审评综述Chemistry Review、Clinical Pharmacology Biopharmaceutics Review(s)和Pharmacology Review等，可获知信息包括处方辅料组成、体内药动学参数、溶出方法、临床研究中的BE信息和药物相互作用、代谢途径等。
而EMA评审报告可以看到处方辅料组成（如使用乳糖，还会公布具体乳糖用量）、制备工艺（包括原料合成反应步数和制剂的工艺）、质量标准（含原料与制剂）、稳定性数据等。
而PMDA审评IF文件同样会公开原料药的理化性质和稳定性、处方辅料组成、制剂形状和重量、制剂稳定性、溶出方法、体内药动学参数（有时会包括亚洲人和欧美人的数据比较）等。
结合FDA、EMA与PMDA的审评信息，再结合原研的制剂专利，我们就能大体制定出制剂研究方案：处方设计的预实验、制备工艺基本工序，以及需重点关注的溶出曲线。PMDA还会公布原研药在全球批准上市时间、适应症等，能够一览原研上市先后次序，为参比制剂选择提供依据。
乳糖用量-见达沙替尼EMA审评报告 Page 42
在所获信息中，我们应该着重关注和分析的：
药物理化性质，
BCS分类，
体内药动学参数（关注变异系数CV），
质量标准。
以下采用实例分别说明信息的解读。
（1）药物理化性质
FDA说明书-11 DESCRIPTION部分一般都会公开原料药的部分性质，如性质和水中溶解度；而Chemistry Review公布的理化性质要多于说明书，包含了如熔点、溶解度的pH依赖性、粒径研究、水合物、pKa、吸湿性、光/热稳定性等；有时也会公布不同规格之间的片重。
以BMS的达沙替尼为例，FDA chemistry review显示达沙替尼为白色结晶性粉末，上市药物为一水合物，药物具有3个pKa，溶解度随pH升高而显著降低。
上述信息表明药物溶出将成为吸收的限速，粒径也将是研究的重要内容。在FDA与EMA的公开信息中均可找到粒径研究内容，让人欣喜的是EMA甚至公开了BMS曾经研究过的D90粒径范围（4-130μm），也显示该粒径范围内不影响药物含量均匀度和溶出。
根据上述信息，我们在仿制药研发中应对粒径范围进行筛选（可以参考EMA公布的D90范围提高研究准确度），以获取自制与参比制剂在各种介质下溶出相似的粒径范围，并制定自制原料粉碎的粒径内控标准。
我们本着相信官方公布的信息原则，但不等于就依赖该信息。因为并未公布原研粒径4-130μm的范围内，不同制剂体内吸收是否存在差异，因此，仿制药还应根据实际测定的体外溶出数据制定适宜的粒径控制范围。
获取溶解度的信息时，笔者认为还应根据药物不同的溶解度特点建立相应的溶出曲线研究策略。
类似达沙替尼的酸溶碱不溶药物，我们除了研究药物在常规的单个介质中的溶出曲线外，还应该模拟体内情况，研究药物从酸性介质转换到中性介质下的溶出情况。
达沙替尼在盐酸介质可完全溶出，但转换到pH6.8的介质后析出，而仿制与参比制剂之间是否存在析出速度或析出晶型的差异，也可能关系到两个制剂之间的AUC之别。特别是当参比制剂可能选择了特殊型号的辅料，辅料具有抑晶作用时，其体外溶出情况将会受到辅料的影响。仿制药也尽可能选择具有同样功能的辅料，甚至辅料用量也需要根据析出速度或程度的对比来筛选，从而降低BE风险。
笔者认为，类似达沙替尼溶解性特点的药物可能会是制剂创新的选择目标，通过制剂提高吸收或降低个体差异，获得临床优势。
晶型也是原料药的关键信息，但在达沙替尼的审评资料中，虽提到了药物具有晶型，且是一水合物，但未披露其是否存在多晶型及原研是否选择最稳定的晶型。但专利信息检索都会披露原研所要保护的晶型，达沙替尼原研专利公开号CN1980909保护的是一水合物晶型；仿制药企业需根据自身考虑，是否规避晶型。
（2）生物药剂学（BCS）分类
获取药物的BCS分类信息，有助于对仿制药研发的BE评估，指导企业选择有针对性的开展体外溶出曲线研究，提高效率。在FDA公开的Chemistry Review 、Clinical Pharmacology Biopharmaceutics Review(s)以及EMA SCIENTIFIC DISCUSSION报告均表明达沙替尼为BCS Ⅱ类（低溶高渗）。
但在渗透性研究时，FDA审评报告对其渗透性研究提出了意见，建议应采用不同的浓度范围研究，而不仅是单浓度50μM。
通过A-B与B-A的渗透系数比值，可以看出达沙替尼为外排蛋白底物，外排将会降低药物吸收；也可看出药物的A-B高渗透性与生物利用度高低并不直接相关（达沙替尼的动物体内生物利用度14-34%），生物利用度还应结合B-A的渗透系数、首过效应等综合判断。
从审评指出的不足也可以看出，即使是BMS等大企业，在实验设计时也未必能够考虑得很全面，毕竟流程再好也是由“人”执行与完成。
同时，FDA的建议可用于指导新药研究时的caco-2实验设计。
不过，按笔者开展caco-2细胞模型渗透性研究的经验和思考，建议在动物体内Cmax的数据获得后，体外caco-2研究B-A渗透性时设置的浓度可包含Cmax附近0.1倍、1倍、10倍浓度，使得体内数据更为可靠。
而针对难溶性药物A-B的渗透性，建议参考模拟肠液中的饱和溶解度设计，毕竟比饱和溶解度更高的浓度在体内也无法实现，或者采用最大剂量在250ml介质中的饱和溶解度为设计依据。
笔者之前的一篇文章（见：一位资深研发总监对制剂开发的体会）把FDA速释片QbD案例中药物认为是BCS Ⅳ类有欠严谨；在此专门详细解读了FDA2015年BE豁免指南[1]。
其对于BCS分类渗透性定义与要求为：
The permeability class boundary is based indirectly on the extent of absorption (fraction of dose absorbed, not systemic BA) of a drug substance in humans, and directly on measurements of the rate of mass transfer across human intestinal membrane.
渗透性分类限度是间接地基于药物在人体吸收的程度（相对于给药剂量下吸收的百分数，而非系统BA），及基于直接测定的透过人肠道粘膜的转运速度。
高渗透性定义：
A drug substance is considered to be highly permeable when the extent of absorption in humans is determined to be 85 percent or more of an administered dose based on a mass balance determination (along with evidence showing stability of the drug in the GI tract) or in comparison to an intravenous reference dose.
相对给药剂量，口服吸收程度≥85%（基于质量平衡研究-同时证明药物在胃肠道的稳定性；或与静脉注射相比）
高渗透性测定依据：
The permeability class of a drug substance can be determined in human subjects using mass balance, or absolute BA, which are the preferred methods, or intestinal perfusion approaches.In many cases, a single method may be sufficient:(i) when the absolute BA is 85 percent or more, or(ii) when 85 percent or more of the administered drug is excreted unchanged in urine, or(iii) when 85 percent or more of the administered drug is recovered in urine as parent and metabolites with evidence indicating stability in the GI tract.
渗透性可通过人体受试者的质量平衡或绝对生物利用度（优先选择）或肠道灌注研究确定；如下任一方法均可：1）绝对生物利用度≥85%；2）或≥85%药物以原型通过尿排泄；3）或≥85%药物以原型和代谢物形式从尿液回收-同时证明药物在胃肠道的稳定性（胃肠道稳定的前提下尿液中代谢物为系统代谢而非胃肠道代谢后再吸收排泄）。
而药物在USP推荐的模拟胃液1h和模拟肠液中3h的降解>5%被认为不稳定。
综上，因FDA QbD案例未公布质量平衡数据、胃肠道稳定性数据，仅通过对比Caco-2 渗透系数大于对照药物美托洛尔（高渗透性对照药物），即认为属于高渗透性，根据FDA2015版BCS分类依据，其理由还显得不够充分。也在此感谢一些朋友的提醒，使得笔者对BCS分类有了进一步的理解。
此外，单一介质单一pH研究渗透系数还存在局限性，开展药物caco-2细胞模型的渗透性研究时，还应考虑培养基的pH值对药物解离程度和油水分配系数的影响，尤其是在pH6-7.4之间分配系数突变的被动扩散性药物；以及培养基中胎牛血清所含蛋白结合程度对渗透系数的影响。
因此，结合FDA在BE豁免指南中所述，在分析原研公开的review时，如无BCS分类或绝对生物利用度数据时，可从临床与药理学review中查找药物的质量平衡研究结果（通常选择14C标记进行），以此来确认BCS分类。
（3）体内药动学参数
主要关注的是Cmax、Tmax、AUC、生物利用度、食物影响、年龄影响、药物相互作用（尤其是与抗胃酸药物）；上述参数基本可以在FDA的说明书中找到，但Cmax、Tmax、AUC、生物利用度可能不会公开具体数值，可到clinical review中查找，根据具体数据判断体内吸收的变异系数（需要关注日本PMDA IF文件中亚洲人种的变异系数），指导预BE的受试者例数。
通过Tmax推测药物关键吸收部位，再结合BCS分类信息，用于指导体外溶出曲线研究。
如药物Tmax为3~4h，BA为85%,自制与参比制剂药物在盐酸介质中30min溶出均大于85%，但f2小于50，此时大可忽略盐酸介质中的f2。
食物通常会延迟药物吸收，对AUC的影响则不一，因为食物会促进消化液分泌，一方面增加难溶性药物溶解度促进吸收，另一方面酶活性增加导致药物被降解，消化蛋白结合增加，均可降低吸收。高龄和抗胃酸药物联用，存在胃酸分泌减少，胃内pH升高，对药物吸收的影响主要比较Tmax，也可指导体外在3.0-4.5介质中的溶出曲线研究。
（4）质量标准：
一般而言，FDA较少公开原研所用API与制剂的质量标准项目，而EMA中都会公布。但查找FDA的Chemistry Review还是可以发现一些有用信息，如API合成起始原料控制：
稳定性：
另外，因达沙替尼70mg规格开发在后，原研根据20、50、20+50mg、70mg体外溶出数据，处方相似性，剂量吸收线性等理由，申请豁免70mg的BE研究亦获得认可，见临床综述Page92；不仅公开了多种介质下的溶出曲线，也公开了原研是如何寻找区分力介质的研究汇总，有助于仿制药开发借鉴。
EMA公开的信息：
可以发现杂质仅用HPLC检测，可以推测API中可能不存在基因毒性杂质，也与Pharmacology Review披露的Ames实验结果相吻合；水分采用KF法测定，是基于API本身是一水合物。稳定性与包装信息均可在审评报告中找到，在此不再一一赘述。
但通过比较多个药物的EMA审评报告，可以一窥不同药物之间的差异，从差异中思考药物本身质量特性，指导仿制药开发。如TAF原料与制剂的信息：
API稳定性：长期稳定性在5℃冷藏条件下考察。
API质量标准项目：关注有关物质涉及3种检测方法，可以推测可能包括基因毒性杂质、挥发性杂质。
制剂稳定性：长期稳定性在25℃条件下考察，对比原料与制剂的差异，猜测制剂或使用的辅料有助于提高TAF稳定性，或针对降解杂质特性放宽杂质限度。
笔者感觉EMA公布的原研信息较以前有所增加，也昭示了官方对仿制药研发的鼓励与支持。
二、参比制剂实验分析
参比制剂实验分析笔者在丁香园线下讨论时曾做过分享，在此不再一一重复，仅针对笔者认为需要着重关注的几个点进行阐述。
片厚：制备与参比制剂相同硬度和大小的仿制药，辅料用量基本相同下片厚会反映出辅料型号选择或制备工艺参数的差异，需要进一步思考如何控制。笔者曾遇到过自制片厚小于参比，在稳定性考察后溶出出现降低问题，改变制粒速度后，提高颗粒可压性，片厚与参比相近后溶出未出现问题。
辅料种类：出于专利规避的考虑，常常需要更换辅料种类，但对于低剂量药物而言，更换辅料种类需慎重，笔者发现过崩解剂的种类会影响API的提取回收率；在不侵权的前提下，尽可能选择与原研相同的辅料。
功能性包衣膜：如肠溶包衣，可GC法测定其中增塑剂的用量，也可测定功能衣膜的玻璃化转变温度，同时需要制备不同组成的衣膜进行比较，推测参比最可能的组成配比。
API晶形：晶型是每一仿制企业都会考虑的，而晶形的研究慢慢开始引起关注。晶形是结晶的宏观表现，体现为针状、片状、柱状、块状、球状等，由于形状的差异，会出现API堆密度、流动性、硬度的差异从而影响制剂性能。
溶出现象：需要制剂人员观察溶出过程中参比制剂是否溶蚀型、迅速崩解型或者介于两者之间；认真比较参比在不同介质中的现象，一是可以了解包衣膜在不同介质中的影响，二是了解辅料本身是否对介质pH、离子强度敏感；同时，溶出过程中颗粒大小、轻重、堆积、溶解时间均应记录，为处方或者工艺开发提供参考。
溶出介质选择：溶出介质的选择是所有参比制剂分析的重中之重，也是BE风险评估的主要依据。笔者认为可参考日本2012年公布的仿制药生物等效性试验指导原则提出的4种类型药物分类 进行溶出介质的选择。但在针对每一特定药物时，还应结合药物自身理化性质和吸收特点适当增减研究。如难溶性药物，在各个不添加表面活性剂中的饱和溶解度均低于给药剂量下的10%，就没有必要进行无表面活性剂的介质溶出研究。而对于表面活性剂用量选择方面，FDA的QbD案例给了很好的说明，药物饱和溶解度无pH依赖性，1%SDS中饱和溶解度与模拟肠液中相近，故更应选择1%SDS，而非FDA公布的2%SDS。
总之，对参比制剂的解析是一项综合性工程，需要制剂人员深入思考。《大学》言：致知在格物，揭示了认识事物的方法；王阳明融合《大学》《孟子》提出“知行合一”；此二者也是我们研究参比制剂，做到仿制药与原研等效的法则。
格物致知即是研究与解析原研，获取其关键特性；知行合一即是在了解原研的基础上进行仿制药开发，获得与原研质量疗效一致的仿制药。
参比制剂解析是知彼，为仿制提供指导方向；但知己同样重要，了解所用API性质、辅料来源与性质、生产设备性能、制备参数设计空间等均是保证仿制药质量稳定重现的关键；制剂研发其路漫漫，知己知彼，方能人剑合一。
参考文献：
[1] Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System Guidance for Industry （2015 draft）
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关于作者
雷伯开，上海医药工业研究院药剂学博士，上海博志研新药物技术有限公司研发副总；十余年制剂开发经验，熟悉多种药物剂型，主持申报过20多个制剂项目，具有丰富的药物制剂研发和管理经验。
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