科研 | BMC Plant Biology：铅胁迫下苦荞麦叶片的转录组分析（国人作品）
编译：云佩b，编辑：十九、江舜尧。
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铅污染是广布的环境问题，对生物造成了毒害。苦荞麦 （Fagopyrum tataricum）是蓼科植物，具有生长周期短、生物量丰富的特点，高度耐铅的特性使其成为了理想的植物修复物种。我们开展本研究以探讨苦荞麦对铅胁迫响应的分子机制。超微结构定位实验表明，铅离子主要富集在叶片的液泡中。设置对照组（CK）、Pb1组（2000 mg/kg硝酸铅）、Pb2组（1000 mg/kg硝酸铅）。采集叶片进行RNA深度测序（RNA-seq），共获得88977条unigene，125203555个碱基。在CK与Pb1之间有2400个上调差异表达基因、3413个下调表达基因，CK与Pb2之间有2948个上调差异表达基因和3834个下调差异表达基因。基因本体（GO）和通路富集分析显示，这些差异表达基因主要与“细胞壁”、“结合”、“运输”以及“脂质和能量”代谢相关。实时定量PCR（qRT-PCR）分析了15个随机选择的差异表达基因，6个基因的表达情况与转录组测序结果一致。在酵母菌株Δycf1中进行外源表达实验发现，过表达CCCH型锌指蛋白14（ZEP14）可增加对铅离子的敏感度，而金属转运蛋白C2（MTPC2）、植物络合素合酶样家族蛋白（PCSL）、液泡阳离子/质子交换器1a（VCE1a）、自然抗性相关巨噬细胞蛋白3和植物络合素合酶（PCS）则增强了变异菌株对铅的耐受度。结合本研究和前人报道，作者提出了一个展示铅胁迫下苦荞麦代谢过程的简化模型。本研究为进一步对苦荞麦铅耐受和积累的生物、分子机制所进行的基因组分析提供了基础。
论文ID
原名：Transcriptome profiling of Fagopyrum tataricum leaves in response to lead stress
译名：铅胁迫下苦荞麦叶片的转录组分析
期刊：BMC Plant Biology
IF：4.03
发表时间：2020.02
通讯作者：陈鹏、徐全乐
通讯作者单位：西北农林科技大学 生命科学院 生物化学与分子生物学系
DOI号：10.1186/s12870-020-2265-1
实验设计
使用“九江”苦荞麦进行实验。种子置于4℃一周作春化处理，45℃去离子水浸泡2小时，播种于40g无重金属污染泥炭基质中。一盆（30cm直径）播种4粒种子。置于温室中，相对湿度60%，昼夜等长，日间气温25℃，晚间气温15℃。栽培15天后，子叶充分舒展，按照干土壤的重量设置各浓度铅处理组（0、1000、2000、5000及10000 mg/kg硝酸铅），每组设置10个重复。铅处理72小时后，选取2000、10000 mg/kg硝酸铅处理组样品进行Illumina深度测序。提取RNA，建立cDNA文库，测序后过滤读段，从头拼装并注释，筛选DEG，进行GO、KEGG通路分析。选取21个基因（包括15个随机DEG和6个铅调控基因）进行qRT-PCR验证。在铅/镉敏感酵母菌株Δycf1中分别融合空载体(pYES2)、pYES2-FtMTPC2、pYES2-FtZFP14、pYES2-FtPCSL、pYES2-FtVCE1a、pYES2-FtNramp3、pYES2-FtPCS，30℃下培养。在SD-Ura (2% 葡萄糖)培养基中培养至OD600=2.0，TE缓冲液梯度稀释，细胞混悬液点于含有0、40、80μmol/L铅离子的SD-Ura (2% 半乳糖)培养基上培养4天。酵母菌细胞以1：1000的浓度接种于含有0或40μmol/L铅离子的SD-Ura (2% 半乳糖) 以观察生长曲线。苦荞麦采样后继续栽培，花期前（栽培30天后）测量各组株高，随后采收植株，烘干研碎，微波消解，原子吸收光谱测定铅含量。另分别采收根、茎、叶，4%戊二醛磷酸缓冲液中固定，磷酸缓冲液洗净，1%（v/w）四氧化锇固定，磷酸缓冲液洗净，丙酮、乙醇梯度脱水，树脂包埋，煤染，置于透射电子显微镜下观察不同部位的铅积累情况。
结果
苦荞麦不同部位的铅浓度及亚细胞分布
铅浓度高达10000mg/kg时，可导致苦荞麦重量减轻，但未见其他影响（图1a、1b）；该浓度设为后续实验的最高浓度。而且，铅暴露对MDA含量、GSH含量、可溶性蛋白和SOD未产生影响，说明铅处理不造成叶片生理学方面的损伤。随后对不同组织中的铅含量进行分析（图1c），当铅浓度超过5000mg/kg土壤的时候，根的铅含量显著增加。相反地，铅浓度在1000~10000mg/kg土壤时，叶片的铅含量已经显著增加。
图1 苦荞麦对铅处理的响应。a 生长于不同铅含量基质的苦荞麦表型。b 生长于不同铅含量基质的苦荞麦株高。分别以0、1000、2000、5000、10,000 mg/kg的硝酸铅处理30天。c 原子吸收光谱（AAS）测得的苦荞麦叶、茎、根的铅含量。数据以均值±标准差（n=3）表示。不同小写字母标出的柱形图代表p<0.05（Turkey事后检验）的水平上有显著差异。
透射电子显微镜（TEM）分析显示铅离子主要分布于液泡内以及叶片细胞壁，而胞内空间分布较少（图2d）。在某些茎细胞中，可见铅离子分布于液泡内（图2e）。根中铅离子主要分布在细胞壁和胞内空间（图2f）。根据以上结果，作者选择叶片进行后续实验。
图2 苦荞麦的亚显微结构以及10000mg/kg铅处理下的铅定位。对照组叶片（a）、茎（b）和根（c）与铅处理的叶片（d）、茎（e）和根（f）。IS，胞间空隙；V，液泡；CW，细胞壁。(A，D，标尺= 2μm; B，C，E，F，标尺= 5μm)
从头拼装及注释
为鉴定苦荞麦叶片中与铅耐受、积累相关的基因，分别从对照组、2000 mg/kg硝酸铅处理组、10000mg/kg硝酸铅处理组各取3个生物学重复，进行cDNA建库，在Illumina HiSeq 4000平台进行转录组测序。
RNA测序所得读段的概况见表1。3组样本纯净读段的平均Q20和GC含量分别大于96%和47%。使用unigene数据库进行拼装，共获得88977个unigene、125203555个碱基，unigene长度介于201-19818bp，平均长度为982.34bp（表1）。至少能显著地匹配到一个数据库的unigene有39321（44.18%）个（表2）。在这些unigene当中，27071（69%）的unigene可进行功能注释。序列对比结果显示，18434（48.38%）个注释的unigene匹配到14个物种，33080（84.14%）个unigene能够以60%~100%的相似度匹配到数据库序列。
表1 苦荞麦链特异性RNA测序的通量和质量
表2 功能注释统计
铅胁迫下的差异表达基因
为鉴定铅胁迫下产生的unigene，把3个文库分为两组（CK vs Pb1和CK vs Pb2），两组中包含了4525个共有DEG。铅胁迫下，1641个DEG上调表达（图3a），2884个DEG下调表达（图3b）。3975（87.84%）个DEG能在NR数据库中注释。
使用超几何分布将DEG分为20个2级GO条目（图3c）。GO富集分析鉴定出145个分子功能（MF）条目、244个生物过程条（BP）目和64个细胞组成（CC）条目。其中MF大类下显著过量表达的条目包括“催化活性”（GO:0003824）、“结合”（GO:0005488）、“转运蛋白活性”（GO: 0005215）和“核酸结合转录因子活性”（GO:0001071）。BP大类下最显著过量表达的条目有“代谢过程”（GO:0008152）、“细胞过程”（GO: 0009987）、“单器官过程”（GO:0044699）和“生物调控”（GO:0065007）。CC大类下最显著过量表达的有“膜”（GO: 0016020）、“膜元件”（GO:0044425）、“细胞”（GO: 0005623）、“细胞过程”（GO:0044464） 以及“细胞器”（GO:0043226）。
CK vs Pb1和CK vs Pb2的KEGG通路富集分析鉴定出铅胁迫下的106个富集通路，17个在p<0.05的水平下显著富集（表3）。对铅胁迫最常见的4个通路为“植物激素信号传导”（ko04075，82）、“植物-病原相互作用”（ko04626，56）、“植物MAPK信号通路” （ko04016, 65）和“苯丙素生物合成”（ko00940, 45）。这些结果表明，铅胁迫主要影响了苦荞麦的与能量代谢、脂质代谢、次生代谢产物、非酶抗氧化剂和氧化磷酸化相关的通路。
DEG的验证及外源表达
为确认RNA测序数据的准确性，选取21个unigene，通过qRT-PCR检测它们在叶片中的转录表达水平。结果表明RNA测序结果与qRT-PCR结果有良好相关性（图4），说明RNA测序结果可靠。
图4 RNA测序与qRT-PCR分析之间的基因表达率验证。15个随机挑选的基因被用于qRT-PCR检验其表达谱。每个平均RNA测序表达量与对应的qRT-PCR值作一散点，进行线性拟合。X、Y轴均作log2变换。每个qRT-PCR均进行3个平行重复。
作者特意分析了6个在铅胁迫下有表达变化的unigene（MTPC2、ZFP14、 PCSL、VCE1a、Nramp3、和PCS）（图5a）。3个基因（ZFP14、PCS和VCE1a）在两个浓度的铅处理组中均有显著差异表达。两个铅处理组的ZFP14表达都有增加，而PCS和VCE1a表达量随着铅离子浓度上升而急剧增加。相反地，MTPC2、PCSL和Nramp3在2000mg/kg铅处理组并无显著上调表达，但它们在10000mg/kg铅处理组的p<0.05（图5b）。
图5 6个DEG表达水平的FPKM热图（a）和qRT-PCR分析（b）。数据为3次独立实验的均值。误差线代表均值标准偏差。***，P < 0.001; **，P < 0.01; *，P < 0.05; ns，不显著。
为确定上述6个基因是否在铅胁迫响应下上调表达，作者将这些基因在铅敏感的酵母菌株Δycf1中异源表达。结果表明，FtMTPC2、FtPCSL、FtVCE1a、FtNramp3 和FtPCS极大地增强了该菌株的耐铅性（图6）。然而，与空载体菌株（pYES2）相比，表达了FtZFP14的Δycf1细胞对0.04和0.08 mmol/L的中等浓度铅离子表现出高度敏感性（图6），在培养板上几乎不生长。与生长于固体培养基上的细胞相比，表达了FtZEP14的细胞在含有0.04mmol/L铅离子的液体培养基中生长48小时后，几乎没有增殖。
图6 6个上调表达基因增强酵母菌的铅耐受度。a Δycf1菌株分别转入了(pYES2)、pYES2-FtMTPC2、pYES2-FtZFP14、pYES2-FtPCSL、pYES2-FtVCE1a、pYES2-FtNramp3、pYES2-FtPCS，在分别含有0、0.04、0.08mmol/L铅离子的SD-Ura (2%半乳糖)平板上生长。标尺=1mm。b、c 分别在0、、0.04 mmol/L铅离子浓度下表达了6个苦荞麦上调基因的菌株生长曲线。数据表示为均值± 标准差（n=3）。
讨论
与普通荞麦相比，苦荞麦具备在污染土壤中高度富集铅的能力。与前人研究相比，本研究首次发现苦荞麦可在含有高浓度铅（10,000 mg/kg）的土壤中生长。因此，借助TEM揭示了苦荞麦主要在叶片液泡中富集铅。尽管观察到大量铅离子通过根吸收并出现在根细胞壁和胞间空隙中，但铅离子并非在根中储存，最终运输到了叶片液泡中。而且，为了阐明苦荞麦在铅胁迫下的铅耐受和积累机制，作者对不同浓度的铅处理组苦荞麦进行了转录组分析。测序产生了88977条unigene，包含了125203555个碱基，平均长度为982.34pb，N50为1730bp。本研究比之前的苦荞麦测序获得了更长的序列和更深的覆盖率（表4）。总结而言，本研究结果不仅从生理角度理解了铅毒害，也为铅胁迫研究提供了有价值的数据平台。
表4 本研究测序结果与其他测序结果的比较
作为细胞第一道屏障，细胞壁阻止了铅进入细胞质中。细胞壁含有的多糖和蛋白可能是铅离子的结合位点。当金属离子沉积在细胞壁时，它们通过细胞膜被转运到原生质体的能力就大幅下降，使植物细胞的正常代谢得以维持。铅暴露使得DEG尤其富集在细胞组成的分组中，包括了细胞壁（GO: 0005618）和膜元件（GO: 0044425）。此外，与多糖合成相关的基因（GO: 0005976、GO: 0044264、GO: 0033692和GO:0010383）在铅胁迫下表达增加，促使细胞壁加厚。在铅毒害的洋葱中也观察到此现象。本研究还发现，与细胞器膜和细胞大分子代谢相关的很多基因也受到了铅暴露的影响。Zheng等人发现，铅通过质外体和共质体通路转运，经过细胞壁固定、自噬和液泡区域化成为磷酸铅而解毒。当此类细胞壁结合位点饱和时，过量铅离子会被转运到原生质体和液泡、高尔基体等细胞器中。这些细胞器减少了铅离子和酶的直接接触，防止了酶失活并阻断了生化反应。细胞壁、膜和细胞器在铅胁迫下共同保护了细胞。
植物对铅暴露作出响应时，会激活各种抗氧化酶以增加ROS。由各种环境胁迫（干旱、盐渍化、温度异常、涝害以及重金属）诱导产生的过剩活性氧（ROS）会干扰膜蛋白结构及功能稳定性，继而破坏细胞稳态。抗氧化系统是保护细胞免受铅胁迫下的高水平过氧化氢、超氧阴离子和单态氧损伤的重要途径。本研究在苦荞麦中鉴定了19个与过氧化物酶体（ko04146）相关的DEG，这与先前的铅引起抗氧化活性增加的报道相一致。Venkatachalam等人发现，植物组织中铅的积累会导致过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的增加。Wang等人发现，铅可引起氧化损伤并增加超氧化物歧化酶（SOD）、CAT、POD、谷胱甘肽还原酶（GR）和APX的活性，同时提高了单脱氢抗坏血酸还原酶（MDA）和非蛋白硫醇的水平。
光合作用是受到高度集成和调控的过程，而光合作用对环境变化的响应会受到铅等重金属的抑制。Chen等人发现，铅在水稻中引起毒害的表观特征包括叶片缺绿、生长迟缓、净光合作用、气孔导度以及叶片蒸腾速率的下降；同时减少了叶绿素1（Ch1）a、Ch1b和胡萝卜素等光合色素的积累。通过维持光合作用能量的平衡，叶绿素1含量以及叶绿体数量的增加都有助于提升职务对铅的耐受度。本研究中，“光合作用”（ko00195）KEGG通路出现富集，CK vs Pb1和CK vs Pb2的大量共有DEG与光合系统（PS）II、Ps I以及F型ATP酶通路有关。铅胁迫对植物的主要影响涉及到对放氧复合体（OEC）的损伤以及对PS I、PS II的抑制。按照这一概念，我们发现本研究中与PS I、PS II通路有关的5个基因出现了不同倍数变化的下调表达。相似地，几乎所有这些DEG，包括与氧气生产有密切关系的PS II核心蛋白D1、D2、CP43和CP47，均出现下调表达。因此，通过减少光合作用相关基因在叶绿体中的表达，损失部分光合作用，可以减少氧气产生并免受氧化损伤。综上，这些结果表明，光合作用通路的调控可能是多种植物对铅胁迫的共同应答方式。
在铅胁迫引起广泛适应性策略的同时，植物也能通过基因调控获取其他解毒和防御机制。一方面，植物拥有对抗铅暴露的非酶抗氧化机制。研究结果表明，苯丙素生物合成（ko00940）是铅胁迫下苦荞麦DEG富集最显著的通路之一（表3）。在该通路中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）是改变黄酮、木质素合成、积累的关键调控酶。而且，包括黄酮生物合成（ko00941）、胡萝卜素生物合成（ko00906）在内的苯丙素生物合成旁路生化反应提供了许多重要的酚类化合物（花青素、胡萝卜素和黄酮）。这些代谢物通过清除过氧化氢和活性自由基协助植物抵御了铅引起的氧化胁迫。另一方面，植物对重金属的初始感知会触发信号传导并启动与胁迫驯化相关的基因表达和细胞过程。环境应激源通过激素信号和MAP激酶（MAPK）通路传到给靶转录因子。植物激素是植物暴露在包括铅胁迫在内的各种应激源时的信号分子。与重金属胁迫相关的激素包括脱落酸（ABA）、生长素、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）。在HM胁迫下，植物激素浓度上升，继而上调MAPK和GSH代谢基因的表达并刺激参与信号传导通路和麸胱甘肽代谢的GSH的生物合成。上游第二信使的信号传导和激素由此传导至下游受体（MAPK）。MAPK信号通路在此过程中国有关键作用，能与其他信号分子作用，调节植物信号传导系统之间的相互串联，最终促进植物对各种应激源的适应并协调植物对应激源的各种响应。
某些在GO或KEGG分析中无显著富集的DEG仍可能参与了铅耐受调节和铅胁迫下的超积累。植物络合素（PC）由植物络合素合酶（PCS）催化麸胱甘肽（GSH）合成，与各种金属形成硫醇键，最终被转运到液泡中。根据多项报道，天然抵抗力相关巨噬细胞蛋白（Nrapms）、金属耐受蛋白（MTP）和液泡转运蛋白（YCF）都是能够增加植物对金属耐受度和超积累的膜转运蛋白。为验证这些基因是否在苦荞麦中参与了相同的过程，研究者将其在酵母菌种异源表达，结果与上述机制一致（图6）。
根据本研究结果，作者推测苦荞麦叶片中的多种代谢过程会受到铅胁迫的影响。如图7所示，铅离子从根转运到叶片后，部分铅离子结合到细胞壁。这些离子的大部分都被阳离子扩散促进子（CDF）、Nramps和其他离子转运蛋白通过铁离子通道或水通道转运到细胞质基质中。铅离子进入植物细胞以后，植物激素浓度发生改变，导致GSH积累。ROS与植物激素作用并参与到MAPK级联途径以激活转录因子。TF调控基因表达水平变化，对铅胁迫作响应以抵御、减轻铅毒害。细胞通过各类细胞器中的APX、CAT、SOD、POD和GR等抗氧化酶维持内稳态。然后铅离子被GSH、PC和其他化合物络合，再被VCE（YCF同系物）、MTP和相关转运蛋白运输到液泡内。这些发现揭示了苦荞麦叶片中参与铅胁迫响应的代谢过程以及铅离子的转运、积累。
图7 苦荞麦叶片对铅离子响应的示意图
结论
总的来说，本研究显示苦荞麦叶片是铅的主要贮存组织，给出了苦荞麦叶片对前胁迫响应的转录组资料。本研究还鉴定出在苦荞麦叶片生长早期的374个与铅暴露、铅胁迫显著关联的DEG。根据GO和KEGG通路富集分析，这些DEG主要与细胞壁、植物激素传导、抗氧化系统和光合作用等初级防御机制相关。另外， 通过在酵母菌中异源表达发现，这些DEG涉及到超积累机制，如：转录因子、金属离子结合及膜转运蛋白。本研究针对性地揭示了苦荞麦叶片的铅耐受和超积累机制的基础，为进一步探讨苦荞麦前胁迫响应分子机制提供了新资料。
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