科研 | Nature 子刊：9个欧洲国家屠宰猪和肉鸡粪便中耐药基因组的丰度和多样性
编译：Mushroom，编辑：小菌菌、江舜尧。
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细菌的AMR (Antimicrobial resistance,AMR) 是个全球性的问题，更为危险的是这种耐药性可以转移给人类，与之相关的人类疾病的发病率和死亡率正在逐年增加。为了明晰这种在宿主之间流动的AMR问题，需要对家畜和人类进行监测。本文对来自9个欧洲国家的181个猪源样本和178个鸡源样本中的获得性耐药基因组进行了量化和鉴定。
结果发现：猪和肉鸡的耐药基因组在丰度和组成上有很大差异，猪的AMR水平更高，而肉鸡的更多样化。mcr-1和optrA等主要AMR的丰度在不同的宿主和不同国家之间都存在差异。同时还发现，AMR水平与各个国家抗生素使用情况有关，而且使用方式相似的国家具有相似的耐药基因组，但功能决定的抗生素耐药基因与总体药物使用情况无关。
论文ID
原名：Abundance and diversity of the faecal resistome in slaughter pigs and broilers in nine European countries
译名：9个欧洲国家屠宰猪和肉鸡粪便中耐药基因组的丰度和多样性
期刊：Nature Microbiology
IF：14.3
发表时间：2018.07.23
通信作者：Frank M. Aarestrup
通信作者单位：丹麦科技大学国家食品研究所基因组流行病学课题组
实验设计
结果
1 获得性耐药基因的鉴定
宿主动物和来源不同的样品耐药性总水平存在显著差异。总体而言，猪的抗生素耐药水平高于肉鸡（图1a）。最高的抗生素耐药水平是在意大利猪样本中发现的，该国是四个耐药性水平最高的样本来源。这些样本耐药性的丰度均在10,000以上。丹麦的11个肉鸡样本AMR是最低的，丰度都在500以下。
我们将每个样本的AMR相对丰度与相应的药物类别进行了汇总，评价AMR水平高的动物和样品来源国家的情况（图1b）。AMR的表型占总耐药基因组的比例在猪的不同来源样本中相对一致：最常见的是四环素耐药性，其次是大环内酯，β内酰胺和氨基糖苷类；其他类型的AMR很少见。与其他国家的猪相比，意大利的猪样本中所含的苯丙醇类AMR的比例要高得多，而且在整个意大利很普遍。保加利亚的一个养猪场也有相似情况。
图1 AMR的丰度和组成
应用ResFinder数据库分析数据，计算每个样本中每个参考基因的AMR丰度。（a）箱形图显示每个样本的AMR总水平，按宿主动物和样品来源分类。每个畜群用一个点来表示。水平箱线表示第一四分位数、中位数和第三四分位数。虚线表示点的范围在第一四分位数−1.5×四分位距范围和第三四分位数+1.5×四分位距范围之间。n = 359个来自独立畜群的宏基因组。除了保加利亚猪（21）、保加利亚肉鸡（19）和德国肉鸡（19）外，每个国家每个家畜物种都是20个宏基因组。（b）每个样本（x轴）每种类型（颜色）的AMR丰度的堆叠条形图，与每个样本内的总AMR成比例。请注意，所有图形都使用两个字母的国家代码：BE，比利时；BG，保加利亚；DE，德国；DK，丹麦；ES，西班牙；FR，法国；IT，意大利；NL，荷兰；PL，波兰。
在肉鸡养殖场中，AMR没有规律性。在国家内部养殖场和国家之间，每种药物AMR的相对比例差异较大。在猪的样本中，四环素、大环内酯类，β内酰胺和氨基糖苷类AMR占多数，但后两个在其中一个畜群中所占的比例非常小。在所有国家中，肉鸡样本中的磺胺和甲氧苄氨嘧啶AMR的丰度比猪样本中要高的多。在许多波兰肉鸡群中，喹诺酮类AMR在复合耐药基因组中占据相当大的比例。按样本和药物类别分类的AMR水平的结果参见堆叠条形图（补充图1）和热图（补充图2）。
为了明确耐药基因组的组成，将相对丰度与基因水平进行汇总，就像对表型水平所做的那样，结果在所有的猪和肉鸡样本中发现了407个不同的基因。
通过分析所有样本耐药基因之间的差异，制作了树状图（图2）。所有的猪样本和肉鸡都分开聚类，这表明猪和肉鸡的耐药基因组是完全不同的。在猪群中，样本来源国家分离情况比肉鸡群中更明显。丹麦肉鸡是一个例外，20个农场中有18个聚集在一起。
为了验证结果的准确性，分析了荷兰三次采样猪群耐药基因组之间的相似性，复合样本之间Bray-Curtis相似度从93.6%到93.7%不等。比利时三次采样猪群的相似度从91.5%到93.3%不等。可以看到两组三次采样的样本分别聚类，这表明取样和测序都是准确可靠的（图2）。养殖场耐药基因组相似性热图见补充图3。
图2 耐药基因组的聚类受宿主动物和国家的双重影响。
树状图显示了所有猪和肉鸡耐药基因组之间Bray–Curtis差异的完整聚类。三次采样的猪群用不同的颜色突出显示。n = 363个来自359个独立畜群的宏基因组。
在猪的样本中，意大利的样本比较突出：cat（pC194）、catP和cat_2等几种氯霉素耐药基因在意大利的含量要比其他国家多得多，在分类水平上对AMR的检测一致（图1）。万古霉素耐药基因VanA家族在几种肉鸡样本中均有共现。
2 核心耐药基因组
经检测发现猪有33个主要抗生素耐药基因，肉鸡有49个主要抗生素耐药基因，其中24个基因在两个宿主间共同存在（补充图7）。对数据分析发现，猪只有9个抗生素耐药基因是特定核心基因，包括组成Van-G万古霉素家族基因、tet（C）、blaACI和cfxA。肉鸡的特定核心基因有25个，包括肠杆菌相关的strAB、sul2、blaTEM和tet（A）基因。
3 差异丰度分析
除一个西班牙养殖场外，新发现的肠球菌相关的耐利奈唑胺基因optrA在保加利亚肉鸡养殖场的丰度显著高于其他国家的肉鸡养殖场（FDR <0.05）（图3），保加利亚和意大利猪群的optrA基因丰度比（除了西班牙的两个猪场）其他任何地方都要高（FDR < 0.05）。新鉴定的粘菌素耐药基因mcr-1在保加利亚和意大利的肉鸡养殖场中明显比在大多数其他国家丰富（FDR < 0.05）。法国、波兰和西班牙的mcr-1基因水平处于中等，而丹麦、荷兰和德国的mcr-1基因水平最低（图3）。
图3 不同国家抗生素耐药基因差异很大。
log丰度（rlog）在y轴上以箱形图和点表示。沿x轴的数字表示平均丰度显著不同的国家数量，并且在所有国家的比较中，根据多重检验（FDR）进行了P值调整。
正如之前热图所示，与其它国家的猪相比，包括cat（pC194）在内的多种氯霉素抗生素耐药基因在意大利猪体内更为丰富。超广谱β内酰胺酶blaCTX-M基因簇1也显示国家依赖性，在西班牙，波兰，意大利，法国和比利时肉鸡样本中的丰度显著高于德国的肉鸡样本。
4 α多样性和丰富性
每个农场中耐药基因组的α多样性指数（图4）。AMR多样性的范围在肉鸡样本中普遍要大得多，而猪样本的多样性分布较窄。西班牙、意大利、保加利亚和波兰的猪和肉鸡中抗生素耐药基因数量最多。Pielou均匀性与Simpson多样性之间不存在相关性（P > 0.05）。猪和肉鸡耐药基因组的稀曲线见附图10。
图4 耐药基因组α多样性和丰富度在动物宿主和国家之间存在差异。
从读数对矩阵中计算出几个指标：Simpson多样性指数、Chao1估计丰富度和Pielou均匀度。
5 细菌基因组和耐药基因组之间的联系
无论是猪还是肉鸡，耐药基因组与细菌组成都显著相关（P = 0.001，图5）；因此，分类学成分相似的样本往往具有相似的耐药基因组成。此外，大多数国家耐药基因组的差异可以用国家间菌体系统的差异来解释。
猪（相关：0.86）和肉鸡（相关：0.88）的AMR与分类学的相关性相似。有趣的是，在猪的样本中，不同的国家对细菌基因组和耐药基因组之间关联性有较大的影响。在荷兰和西班牙的猪群中，基于细菌属和抗生素耐药基因的分类得到了类似的结果（图5b）。但在德国的养殖场，耐药基因组和细菌基因组的分类关系复杂。（图5d）。
图5 分类学变化与耐药基因组的关系
利用猪（a）和肉鸡（c）种群的Procrustes分析，细菌和AMR丰度谱相互关联，从而比较两个多变量数据集。这些线显示了Procrustes残差；这个图显示了当用耐药基因组（点端）与细菌基因组（非点端）相比较时的排列变化。用vegan的protest函数推导出相关系数和显著性。猪（b）场和肉鸡（d）养殖场的残差线图可以更容易地比较残差大小，从而显示出养殖场之间菌体与耐药性关联的差异。
6 AMR和药物使用的关系
欧洲药品署兽医抗菌药物消费监测（ESVCA）的国家抗生素总体使用情况（AMU）与猪和肉鸡的AMR呈正相关。在猪中，当AMU增加1loge（AMU增长36.8%）单元时AMR的丰度增加1,736-3,507（图6a）。在肉鸡中，当AMU增加1 loge单元时AMR的丰度增加68-1,330（图6b）。对于猪来说，国内养殖场之间的差异是国家之间差异的7倍，而肉鸡国内养殖场之间的差异是国家之间差异的4倍。
图6 国家兽医抗生素使用情况与AMR的关系
平均抗生素使用情况和混合样本总AMR的散点图。（a）平均兽药使用量与养猪场AMR总水平之间的关系。n = 181个独立畜群。（b）平均兽药使用量与养鸡场AMR总水平之间的关系。n = 178个独立畜群。
对各养殖场的治疗数据进行了重复回归分析（补充图11），这些数据与AMR的相关性低于国家兽药使用数据。猪的相关性仍然存在，而肉鸡的相关性不显著（P > 0.05）。保加利亚两种家畜的抗生素使用率报告都很低，而AMR很高。丹麦农场报告的肉鸡平均抗生素使用情况高于保加利亚和荷兰，但总的AMR要低得多。
7 功能性抗生素耐药基因
除了使用ResFinder外，我们还对功能耐药基因数据库（FRD）进行了大量分析，以阐明功能决定的抗生素耐药基因是否与ResFinder中的获得性抗生素耐药基因相似。使用FRD，发现了与使用ResFinder相似和不同的结果。在猪和肉鸡的样本之间仍然存在完美的分离，但是在猪身上的样本来源国家分离没有使用ResFinder时那么明显（补充图13）。虽然可以用两个坐标轴来解释差异较小的原因，但是在猪样本的主坐标分析图中德国和西班牙的样本现在聚集在一起，其他国家的样本也更加相似。FRD对耐药基因组丰富度的结果与ResFinder相似都表明：西班牙、意大利、波兰和保加利亚的猪和肉鸡样本中的耐药基因组丰富度均高于其他国家，并且经分析发现功能决定的抗生素耐药基因与总体药物使用情况无关。
结论
1猪和肉鸡的耐药基因组在丰度和组成上有很大差异。并且猪比肉鸡更受国家的影响。猪的AMR水平更高，而肉鸡的更多样化。
2无论是猪还是肉鸡，耐药基因组与微生物群的细菌组成都显著相关，并且猪的相关性受样本来源国家的影响。
3获得性抗生素耐药基因的总水平与国家兽药总体使用情况有关，而且使用模式相似的国家具有相似的耐药基因组，但功能决定的抗生素耐药基因与药物总体使用情况无关。
评论
AMR被认为是对人类健康的最大威胁之一。家畜的AMR被认为是可能危及人类健康的一个重要来源。除了人畜共患病原体中的AMR外，共生细菌中的AMR也令人担忧，因为它具有水平传播的能力。
多项研究表明，AMR与家畜中抗生素的使用情况成正比。已经有几个国家实施了监测方案，监测不同宿主AMR的发生情况，长时间跟踪分析发展趋势。目前的监测工作主要是培养指示菌，然后进行表型AMR的测定，但是这种方法只针对肠道菌群中数量有限的物种，因此只能分析耐药基因组的一小部分。近年来，宏基因组学方法在AMR分析中应用较多，其全面性和数据的可靠性得到了一致认可。本研究从9个欧洲国家采集了181个猪群和178个鸡群的样本，这些样本的宏基因组测序使我们对欧洲猪和肉鸡获得性耐药基因组的丰度、多样性和结构产生了一定的了解，并且通过分析我们还得知了抗生素耐药基因丰度与国家兽医抗生素使用情况之间的关系。本文的结果和原始数据可作为未来宏基因组AMR监测的参考。
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