2016年的单细胞转录组数据居然发oncotarget ！！！

不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，很幸运聚集了五个小伙伴携手共进，我们承诺不间断更新5个月，把我们这两年的学习成果全部掏出来给大家，包括5个栏目：

  1. 文献速递（简短介绍，扩充知识面）

  2. 文献详解（图文并茂带来大家系统性学习）

  3. R与Bioconductor的技巧（书籍翻译，妙招共享）

  4. scRNAseq的GitHub的书籍翻译（原汁原味的名校教程）

  5. 全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享

希望大家能有所收获！

现在你看到的是文献速递

文章信息
文章发表于：Oncotarget. 2016; 7:66069-66076. doi.org/10.18632/oncota 是深圳大学及其附属罗湖医院团队做的，在BGI测序。题目是：Single-cell analyses of transcriptional heterogeneity in squamous cell carcinoma of urinary bladder 这篇文章就一幅图！！！而且是对一个病人。
癌症背景知识
很明显，关注的癌症是： squamous cell carcinoma of the bladder (SCCB) ，是膀胱癌症的一种，但是只占10%左右，不过比起占比非常高的urothelial carcinoma (UC)来说，更容易复发，更恶性！

 

单细胞转录组

不过该文章采用的单细胞转录组方法比较不常见，是 single-cell tagged reverse transcription (STRT) ，使用 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) 挑选细胞，拿到了 75 tumor cells, 18 normal cells and 3 negative control ，平均每个细胞测序数据量是0.38M ，平均成功比对率是64.87%，具体统计信息可以查看Supplementary Table S1. 唯一的过滤标准是表达基因数量要超过3000，这样剩下 67 tumor cells and 7 normal cells。

使用的是HiSeq2000测序仪，Single-end reads of 50bp were generated along with 8-bp index reads corresponding to the cell-specific barcodes.

数据处理使用的是 Tophat 2.0.12 ，NCBI 37.1 assembly， Reads Per Million (RPM) ， 很简单，比较奇怪的是基因表达定量他们居然用自己的perl脚本，我感觉很诡异，现成的featureCounts和HTseq居然不用。

差异分析

很明显，作者把差异分析当做了重头戏，而且完全是把单细胞转录组测序数据用传统的bulk转录组分析方法来处理的，比如使用NOISeq包(参数是； “q = 0.999, graphic = “MD”)来找差异表达基因。统计学显著的上调下调基因就去做GO/KEGG等数据库富集分析，再讨论一下富集分析结果在膀胱癌的生物学意义即可。

高级转录组数据分析

仍然是传统的bulk转录组分析方法，这里用了Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA)，挑选5530高表达变异的基因，得到48个模块，然后集中分析前5个比较大的基因模块，同样也是去做GO/KEGG等数据库富集分析，再讨论一下富集分析结果在膀胱癌的生物学意义即可。加多了一个分析，就是在这些模块里面找hub gene，讨论一下这些在膀胱癌的生物学意义即可。 至于WGCNA如何做，看我在菜鸟团博客写的教程即可。

单细胞水平的肿瘤异质性

既然是一个病人的67个肿瘤细胞的单细胞表达矩阵，那么没办法很清晰的分群也很正常，这些细胞的相关系数差异很大 r ~ 0.15 to 0.89，说明了肿瘤异质性。然后仅仅是针对那些高表达量基因 (RPM > 100)来根据coefficient of variation (CV)值来挑选the most 100 variably and most 100 stably 基因集，理所当然的，变化剧烈的那些基因是癌症相关的，表达量稳定的那些基因是housekeeping genes。

意义

The fresh tissues (cancer and normal control specimens from one patient) were minced (5-10mm in maximum dimension) during surgery, and kept in cryopreservation medium (10% DMSO+90% DMEM medium with 30% FBS) under -80°C.

病人其实已经去世了！

The patient died six months after the operation because of intestinal metastasis.

Upregulation of CCND1 was uncovered in various cancers, indicating its potential effects on tumorigenesis process, providing a therapeutic target of this patient.

数据可以重新下载并且分析

数据都在NCBI的SRA数据库：SRP078083 ，查看我在生信技能树的教程就很容易理解： vip.biotrainee.com/d/33

很容易下载样本列表及原始数据，然后自己重新分析：ncbi.nlm.nih.gov/Traces

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