含塞姆利基森林病毒复制子hiv多表位核酸疫苗构建和表达.pdf

球AIDS流行的病原,根扼env和gag基因的序列,可以将HIV一1分为M亚型、0亚型和N亚型。各亚型病毒基因的序列差异超过45%,同一亚型之内有3%一23%的差别。O亚型内各毒株也有高度的异质性。HIV亚型之间的重组十分多见,大约lo%的HIV分离株是重组的嵌合体。重组流行毒株(circulate recoⅢbi_nantforms,cRFs)指重组和嵌合病毒,目前已经确定了16个重组流行毒株。HIV一1和HIV一2基因有非常高的变异率,它们的分离株彼此都不相同,这是由于病毒基因的交变、插入、缺失和不同病毒株之间的基因重组引起的。这两型病毒都引起相同的临床症状, 但HIv_2的致病力较低。图1 HIV病毒形态结构图 Fig.1 St“cture of HIV patical 2.1?v一1的基因结构 HIV基因组为两条相同的单股正链RNA,两单体由氢键组合成二聚体。HIV一1 基因组长约9.3kb,HIV一2基因组长约9.7kb。基因组的5 7端有帽结构,3’端有Poly(A)尾,两端具有逆转录病毒的基本结构基因LTR(长末端重复序列),中间有9个开放读码框架(ORF),3个结构基因,即编码核心蛋白的gag;编码外膜蛋白的env;编码病毒复制所需逆转录酶、整合酶、蛋白酶的pol。HIv一1还有6个调节基因tat,rev,nef,vif,vpr和vpu,分别编码相应的蛋白?。 2 延边人’≯埘{中f?i L2文——时.i 2.2 HIV的基因编码的蛋自在编码HIV 1结构蛋白的三个基因中,p01基因产物是一种的体蛋白,能够被依次切割形成反转录酶、蛋白酶、整合酶,其中P66蛋白为逆转录酶,P32蛋白则为整合酶。在p01和gag基因重叠区内的一段序列,可编码具有蛋白酶活性的P22蛋白,它在裂解上述HIV前体蛋白成为终末成熟蛋白的过程中起着主要作用。这些转录酶蛋白和整合酶蛋白对产生HIV的前病毒形式是必要的。gag基因编码~个相对分子量为55kDa的前体蛋白P55,然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成P17、P24和P15等三个蛋白质,由它们构成外壳P24和内膜P17;P15进一步裂解成与病毒刚A结合的P9和P7。这些蛋白是感染性病毒颗粒组装所必需的成熟核心蛋白。env基因的初产物是160kDa的包膜糖蛋白前体Gpl60,该前体蛋白在蛋白酶作用下被切割成暴露于病毒包膜蛋白之外的外膜蛋白Gpl20和与细胞的C矾受体结合的穿膜蛋白Gp41。 HIV一1的6个调节基因对病毒复制起关键作用”1。其中Tat基因编码一种 14kDa的nt蛋白,Tat蛋白在HIV基因组复制起始和转录延伸过程中发挥重要作用:rev基因编码一种18kDa的Rev蛋白,Rev蛋白可促使HIV基因的表达, 由早期向晚期转化:Vpu蛋白是一种16kDa的跨膜蛋白,Vpu蛋白可作用于 CD.一gpl6(】复合体使二者解离,从而促进HIV一1颗粒从细胞膜上释放:Nef蛋白清除细胞髓表西已存在的C耽+分子,又抑制经LTR调节的}l,V复制和基因表达, 并且还与?V病理过程有关:vpr基因编码一种相对分子质量约14kDa的V矗蛋白,它是一个反式激活因子,可作用于HIV LTR,促进HIV的复制;vif基因的产物是23kDa的Vif蛋白,Vif蛋白则与HIV病毒的感染性有关,Vif蛋白缺失可使病毒的感染性降低1 000倍,这种作用可能是由于Vif蛋白具有蛋白酶活性, 从而影响HlV膜蛋白的成熟过程。 2.3?V的遗传和变异 HIv的一个显著特点是具有高度变异性,这是HIV在免疫和药物选择压力下赖以生存的基础,也是病毒难以清除的主要原因和疫苗研制的主要障碍。高度变异性的分子基础是其逆转录酶的忠实性较差,缺乏3’一5’外切核酸的校读功能, 导致RNA转录为DNA时经常出现错误,据估计每一轮HIV—l的复制都会引入10个错误的碱基,突变的类型包括碱基替换、移码和缺失。在DNA合成的过程中由于2个共包装的病毒RNA分子之间的模板转接以及不同亚型病毒之间的重组,可以引入更多的突变。在HIV感染的个体,HIv变异株出现的频率是HIV复制周期的函数。现在已经知道在HIV感染的所有阶段,都有持续高水平的HIV复制,有时相对较低水平的血浆HIV RNA是通过高水平的HIV复制和破坏所造成的,研究也显示更高水平的11Tv复i例发生在外周组织中,1#别是淋巴器官。感染过程中每天发生的大量复制周期提供了产生大量变异毒株的机会。每天HIV基因的每一个位筲都可能引入突变。H】V的快速复制速率加上高突变率,使HIV从原发感染时的状态进化为一群遗传差异很大的病毒,每一个成员都保存了生存所必需的基因,但是在不妨碍复制的基因位点上有细小的差异,结果导致出现高度分化的群体。由于这样的快速复制、突变、选择,HIV突变可以在几天之内就出现。由于病毒群有较大的基因多样性,经常是在抗病毒治疗丌始之前,携带耐药性突变的病毒就己经存在了, 一旦开始治疗已经存在的耐药性病毒就会快速繁殖,很快占据主导位置,快速复制和进化的后果是cD。+T细胞的破坏,出现毒力更强的毒株.逃脱免疫系统的控制和抗病毒药物的抑制,促进了病程的发展。 2.4?v的受体和细胞亲嗜’陛 HIV利用宿主细胞表面特异性受体来起始感染,CD.分子是HIV的主要受体。除此之外,病毒的感染还有赖于辅受体的存在,这种辅受体”1是趋化因子(chemokine)的受体,R5和cxCR4。在HIV感染细胞时,病毒被膜耱蛋白gI)120首先与细胞表面的受体CD,分子结合,诱导gpl20分子的构象发生改变,使得gpl20的第三超变区暴瑶,然后这个区域与辅受体结合。gpl20与 cD.分子和辅受体结合后,使与之相连的病毒跨膜糖蛋白gp41分子的疏水氨基端插进宿主细胞膜,启动病毒外膜与宿￡细胞膜的融合,从而建立感染。 2.5?V的生活周期 HIV的繁殖周期与大多数的反转录病毒相同。首先HIV的被膜糖蛋白Gpl20 与宿主细胞表面的受体和辅受体结合,Gp4】分子启动病毒外膜与宿主细胞膜的融合,病毒的核心部分进入宿主细胞。在宿主细胞质中,双拷贝的单链病毒RNA 基因组迅速被反转录并合成为双链DNA。病毒DNA合成后,与基质蛋白、整合酶及病毒其他蛋白组成核蛋白复合体,经细胞的核输入途径进入细胞核。当感染细胞受到一些因素刺激时,以前病毒形式存在的HIV基因组的转录被启动。成熟的感染性病毒颗粒的合成发生于RNA基因组完整转录物的产生及各种病毒基因表达蛋白质之后。Rev蛋白结合新合成的、未剪接或剪接一次的病毒RNA,在其他蛋白质的协同下,把它们从细胞核运输到细胞质中。新转录的病毒RNA进入细胞浆,全长的和多种剪接形式的mRNA作为病毒蛋白质合成的模板,其中全长的RNA 还作为基因组。病毒蛋白把全长RNA包装在核蛋白复合体中,开始了感染性病毒颗粒的组装。'?1。此核蛋白复合体包括下一次感染所需要的Gag核心蛋白和jol 基因编码的酶。这个核蛋白复合体接着被包裹在膜性外壳中,通过出芽方式释放出细胞,再开始新的生活周期。逛边人。':’f乎}