编译：阿温，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
磷由于乳腺癌细胞的高度异质性，且其生长和转移涉及多种途径，使得单药治疗不能够靶向肿瘤，所以转移性乳腺癌的靶向治疗仍然是一个挑战。因此，同时靶向多途径的合理治疗方案可能提供更好的抗癌效果。我们使用两种营养剂——腺苷蛋氨酸(SAM)和维生素D (Vit.D)促激素[25-羟基维生素D，25(OH)D]的组合来检验这一假设，它们改变肿瘤生长和转移相关基因的表达。我们的结果显示，SAM和25(OH)D单药治疗在体外显著降低了一组乳腺癌细胞株的增殖和克隆形成，并在体内抑制了肿瘤的生长、肺转移和乳腺癌细胞在骨架上的定植。然而，这些影响在联合用药中更为明显。RNA测序显示，在联合治疗中，癌症的关键相关信号通路的转录组足迹比任何单一疗法都要广泛。此外，比较我们的转录组分析与公共癌症相关数据库的差异表达基因，表明联合治疗上调了在体内骨转移中下调的免疫相关通路的基因。SAM和Vit.D是经批准的具有安全性的保健药物，这种联合治疗可以作为一种降低乳腺癌相关发病率和死亡率的新策略。
原名：An enhanced chemopreventive effect of methyl donor S-adenosylmethionine in combination with 25-hydroxyvitamin D in blocking mammary tumor growth and metastasis
译名：甲基供体S 腺苷甲硫氨酸联合25羟基维生素D阻断乳腺癌生长和转移的化学防御作用
期刊：Bone Research
IF：11.508
发表时间：2020.7.22
通讯作者：Shafaat A. Rabbani
通讯作者单位：麦吉尔大学健康中心
DOI号：10.1038/s41413-020-0103-6
体外抗癌作用
转基因小鼠体内抗癌作用
小鼠骨转移模型
转录组分析及信号通路富集分析
公共数据库分析
1. SAM联合25(OH)D在体外抑制细胞增殖和克隆形成
由于癌症是细胞增殖和生存不受控制的一种疾病，人源(ZR-75-1、MDA-MB-231)和鼠源(PyMT-R221A、E0771) 乳腺癌细胞系具有不同的内源Vit.D受体表达水平(图S1)，这些细胞用于检验SAM和25(OH)D联合治疗的体外生长抑制作用。使用图1a所示的处理方案，我们发现，与同一时期仅用溶剂对照处理的细胞相比，单剂SAM (200 mol·L−1)显著降低了细胞的增殖(图1b)。25(OH)D (100 nmol·L−1)单药治疗也显著抑制了PyMT-R221A、E0771和ZR-75-1细胞的生长。值得注意的是，对癌细胞生长的抑制作用在SAM和25(OH)D联合用药处理的细胞中更为显著(图1b)。接下来，我们通过计算药物相互作用系数(CDI)来表征SAM和25(OH)D之间的相互作用性质是协同、相加还是拮抗:CDI = AB/(A×B)。CDI值表明，在本研究中使用的剂量下，SAM和25(OH)D的组合表现出一种加性效应到中度协同效应(图S2)。我们也用SAM, 25(OH)D, and SAM + 25(OH)D治疗正常人乳腺上皮细胞(HBEC)，发现无显著变化，表明这种治疗在体外使用的药物浓度是无毒的(图S3)。
接下来，为了进一步检验其抗增殖作用，我们通过克隆形成实验研究了不同处理对这些细胞系克隆形成能力的影响。结果显示，与空白对照组相比，以及与SAM或25(OH)D单独处理组相比，SAM + 25(OH)D组合降低了四种细胞的克隆形成能力(图1c)。综上所述，联合使用SAM和25(OH)D可能是一种有效治疗乳腺癌的策略。
图1 SAM、25(OH)D及其组合在体外的作用。
2. 在转基因MMTV-PyMT小鼠中，SAM和25(OH)D联合应用可延缓乳腺癌的发生，降低肿瘤的生长和肺转移
为了评估联合治疗是否影响乳腺癌的发生和体积，我们使用了特征明确的转基因MMTV-PyMT小鼠来模拟人类乳腺癌的逐步发展。MMTV-PyMT雌性小鼠在出生后28天随机分为4个不同的治疗组：口服对照组、SAM (160.0 mg·kg−1 /天)口服、25(OH)D (40.0 ng·kg−1 /天)腹腔注射，以及相同浓度的SAM和25(OH)D联合治疗(图2a)。从出生后第35天开始，观察对照组和实验组动物腋窝和腹股沟乳腺肿瘤的出现情况。我们发现，空白治疗的对照组小鼠在42天左右的年龄自发地出现可触及的乳腺肿瘤，而在所有三个治疗组中，肿瘤出现的时间都明显延迟(图2b)。对照组肿瘤出现的中位值为出生后45.5天，在25(OH)D (log-rank P = 0.05)和SAM (log-rank P = 0.006)单药治疗组中，肿瘤出现的中位值分别延迟到49.5天和52.5天(log-rank P = 0.021)(图2b)。在使用SAM + 25(OH)D联合治疗的组中，观察到肿瘤出现进一步延迟到56天(log-rank P = 0.003)。然后，测量每只动物从第49天到第77天处死的乳腺肿瘤的总体积(每只动物腋窝和腹股沟的肿瘤体积之和) (图2c)。我们的数据显示，在所有三个治疗组中，原发性乳腺肿瘤体积显著减少(图2c, d)。然而，这些效应在SAM+25(OH)D治疗的动物中更为明显，这表明在体内，与单药治疗相比，联合治疗具有更强的治疗潜力。
众所周知，长期服用Vit.D的不利因素之一是可能出现高钙血症。因此，所有动物处死后收集血清，并检测钙水平和其他生化指标。对照组和实验组的血清钙及其它生化指标均无显著差异，说明在这些剂量下，SAM和25(OH)D在体内没有不良反应。此外，对照组和不同处理组的总体重随时间变化无显著差异(图S4)。
肿瘤组织的免疫组化评估表明，三个治疗组与对照组相比，ki67表达明显减少，SAM + 25(OH)D组减少最多(图2e)。这进一步证实了接受联合治疗的动物肿瘤体积的减少。
未交配的雌性MMTV-PyMT小鼠在10-12周时，由于原发乳腺癌自发发生肺转移，使得能够评估治疗方案的抗转移潜力。第77天，四组动物均处死，取肺组织。我们发现，四组乳腺肿瘤细胞均侵袭肺部(图2f)。然而，通过测量肺中微转移的总面积，与对照组相比，治疗组的肺转移面积显著下降(图2f)。此外，三组中SAM + 25(OH)D联合治疗组的转移率最低，说明SAM + 25(OH)D联合治疗不能阻断肺转移的发生，但能显著降低转移的发生。
治疗的疗效取决于其在合理时间内的血清生物利用度，使其能够被吸收并随后分布到靶组织。因此，我们采用LC-MS/MS进行一项实验以确定口服给药后血清中SAM生物利用度的持续时间。我们发现SAM在给药后30分钟达到峰值，而在240分钟后其水平下降到基线水平，这表明可能被不同组织摄取(图S5a)。接下来，我们比较了对照组和经SAM处理的实验组在第11周时的SAM水平，发现实验组的SAM浓度增加了3.6倍(图S5b)。
然后，我们通过LC-MS/MS检查腹腔注射25(OH)D的血清生物利用度，发现与对照组相比，经处理的动物体内代谢物显著升高(图S6a)。此外，注射25(OH)D可以提高动物血清中1,25(OH)2D和24,25(OH)2D的水平(图S6b, c)。综上所述，这些结果表明，在本研究使用的剂量下，SAM和25(OH)D均具有生物可利用性。
图2 SAM、25(OH)D及其联合对MMTV-PyMT转基因雌性小鼠乳腺癌发生、生长和肺转移的影响。
3. 在同基因小鼠模型中，联合使用SAM和25(OH)D可抑制骨内乳腺癌细胞的生长
然后，我们使用具有免疫能力的同基因小鼠模型来评估SAM + 25(OH)D在骨骼上减少乳房肿瘤的作用。由于PyMT-R221A细胞最初是从MMTV-PyMT乳腺肿瘤中提取的，因此我们将该细胞植入到雌性FVB小鼠中，同时也是为了保持研究中使用的不同体内模型之间的遗传背景的一致性。按照图3a所示的治疗策略，对照组和不同治疗组的小鼠从注射肿瘤细胞后第3天开始，每天接受治疗，直到第14天被处死。之前的研究已经表明，到这个时候，骨皮质已经被这些肿瘤细胞破坏，它们开始在周围的软组织中生长。处死后收集所有小鼠的胫骨，HE染色骨组织部分，结果显示联合治疗组的肿瘤发生率低于对照组和单药治疗组(图3b, c)。此外，与单药治疗的动物相比，联合用药组的骨骼肿瘤面积最小(图3d)。总之，这些结果表明，SAM + 25(OH)D联合治疗可减少乳腺肿瘤在骨骼中的生长，而骨骼是乳腺肿瘤细胞迁移并在临床环境中形成继发性肿瘤的主要部位。
图3 SAM, 25(OH)D及其联合对乳腺癌细胞在骨内定植的影响。
4. 联合处理对PyMT-R221A转录组的影响
为了研究与SAM或25(OH)D单药治疗相比，该联合疗法能增强抗癌效果的分子机制，我们通过空白对照、200 mol·L−1 SAM、100 nmol·L−1 25(OH)D和SAM + 25(OH)D处理样品的RNA测序(RNA-Seq)比较了药物诱导PyMT-R221A的转录组变化。使用DeSeq 2 (log2 fold change > 0.5和FDR < 0.05)绘制对照组和不同治疗组间差异表达基因(DEGs)。在SAM vs 对照组、25(OH)D vs 对照组和SAM + 25(OH)D vs 对照组中分别共检测到387(182上调，205下调)、269(141上调，128下调)和652(306上调，346下调)个DEGs(图4a)。三个比较组中前50个DEGs的层次聚类情况分别见图S7。维恩图显示，不同治疗组中常见和独特的上调和下调基因的数量不同，表明联合治疗的转录序列比任何单一治疗都要广泛(图4b)。Circos图显示了不同处理组中上调和下调基因在数量和功能上的重叠(图4c)。与单药治疗相比，联合治疗提供了独特的功能，如与单药治疗相比，联合治疗中上调和下调基因的Circos图谱中显示较多的蓝线数量。SAM、25(OH)D和SAM + 25(OH)D治疗通常靶向106个基因(43个上调，63个下调)，表明这些药物的分子靶点重叠(图4b，S8)。重要的是，联合疗法不仅仅是两种单药疗法的总和，而且它有其独特的足迹，涉及改变了331个基因的表达(162个上调，169个下调)，表明可能调节了其他的生物信号通路。
使用三个治疗组的DEGs进行GO功能富集分析，显示SAM + 25(OH)D上调的基因参与了关键的生物过程，如调节I型干扰素的产生(GO: 0032479)、对病毒的防御反应(GO: 0051607)，而下调的基因参与了重要的癌症相关过程，如缺氧反应(GO: 001666)、血管生成(GO: 0001525)等，如图4d所示。
图4 PyMT-R221A细胞的转录组分析。
5. 联合治疗影响了富集的信号通路
为了进一步了解SAM + 25(OH)D联合治疗影响的功能途径，使用KEGG和Reactome数据库进行富集分析(图5a)。我们发现，联合治疗中上调基因明显富集“干扰素α/β信号通路”(图5a)。另一方面，联合治疗下调的基因富集的信号通路是“HIF-1信号通路”(图5a)。GSEA富集分析进一步证实了联合治疗后基因富集于干扰素α/β和HIF-1信号通路(图5b)。我们还对SAM、25(OH)D和SAM + 25(OH)D联合治疗共有的106个DEGs进行了pathway分析，发现HIF-1信号通路是这些基因富集最多的信号通路(图S9)。然后，我们分析了由SAM + 25(OH)D联合治疗唯一调控的331个DEGs，发现显著富集“干扰素α/β信号通路” (图S10)。
接下来，我们使用qPCR分析上调(干扰素α/β信号通路)和下调(HIF-1信号通路)基因而验证RNA-Seq结果。“干扰素α/β信号通路”中几个关键基因仅在SAM + 25(OH)D联合治疗中显著上调，而两种单药治疗中均未上调(图5c)。“HIF-1信号通路”中的基因在联合治疗组中表达显著下降，这一趋势在SAM或25(OH)D单药治疗中也有体现(图5c)。通过qPCR对图2中对照和处理小鼠的肿瘤进行RNA测定，也得到了类似的结果(图S11)。我们还测量了对照组和处理的PyMT-R221A细胞中Vdr、Cyp27b1和Cyp24a1的水平，发现联合治疗后的Vdr、Cyp27b1和Cyp24a1的表达相对于对照组细胞有差异(图S12)。
图5 RNA-Seq鉴定的基因功能验证。
6. 比较联合治疗与公用乳腺癌数据库的DEGs
我们比较了我们研究的SAM + 25(OH)D联合治疗的DEGs与公共数据库中小鼠自发骨转移模型中不同调控基因的表达序列(GSE37975)。使用GEO2R工具分析了GSE37975中差异表达基因，与对照相比，在骨转移(脊柱)样品中共获得6305个(2833个上调和3472个下调)差异表达基因。然后我们将GSE37975中的2833个上调基因和3472个下调基因与本研究中SAM + 25(OH)D治疗中346个下调基因和306个上调基因重叠。我们的分析显示，与空白对照PyMT-R221A细胞相比，转移性骨组织中GSE37975下调的53个转录本与SAM + 25(OH)D治疗上调的基因显著重叠(图6a)。在这53个转录本中，有27个被SAM + 25(OH)D治疗特异性上调。另一方面，通过超几何检验，在骨愈合小鼠模型中上调但被SAM + 25(OH)D治疗下调的42个转录本的重叠不具有统计学意义(图6a)。接下来，我们重点研究这27个基因，它们在骨转移中下调，但在联合治疗中唯一上调。蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析显示显著富集两条通路，调节I型干扰素的产生和对病毒的防御反应(图6b)。
图6 比较SAM + 25(OH)D联合治疗与小鼠骨转移数据库中的DEGs。
癌症表型涉及多个基因通路的同时改变，其中肿瘤抑制基因的高甲基化和肿瘤促进基因的低甲基化。因此，我们将甲基化剂SAM与另一种常用的营养制剂Vit.D结合，Vit.D是一种通过核受体激活表观遗传重编程和去甲基化的化合物，所以可以同时靶向致使癌症甲基体异常的高甲基化和低甲基化。我们发现，与对照MMTV-PyMT小鼠相比，联合治疗在转基因小鼠中形成自发肿瘤的时间上有明显的延迟。此外，与对照组和单药治疗相比，联合用药在缩小肿瘤体积方面的疗效显著提高。联合治疗还减少了肺组织的转移负担，肺组织是原发肿瘤细胞转移的主要部位。
骨转移是晚期乳腺癌的主要并发症之一，引起顽固性骨痛、高钙血症、骨脆性增加、神经压迫等，导致发病率和死亡率较高。总的来说，这些并发症严重影响癌症患者的生活质量。尽管其广泛发生，但只有少数治疗方案可用于治疗骨骼转移。此外，大多数可用的治疗方案都是姑息性的，旨在缓解骨痛和减少骨组织的破坏。因此，对于减少继发性肿瘤向骨骼生长的新型治疗干预手段的需求尚未得到满足。为了实现这些目标，我们使用PyMT-R221A乳腺癌骨内定植模型来评估SAM + 25(OH)D的抗癌潜力，发现联合治疗显著降低了胫骨区域肿瘤的生长。
综上所述，本研究充分证明了SAM + 25(OH)D联合治疗乳腺癌的体内外治疗效果(图6c)，可单独使用或与目前一线治疗并行使用，以改善患者预后。SAM + 25(OH)D联合治疗特别吸引人的地方在于，它们都有长期的安全记录，可以作为降低癌症相关发病率和死亡率的预防和治疗药物，且可长期使用。
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