可治性罕见病—范可尼贫血
一、疾病概述
范可尼贫血( Fanconi anemia，FA)是一常染色体隐性遗传和（或）X-连锁隐性遗传疾病，为先天性骨髓衰竭综合征中最常见的疾病，全球发病率为0. 3/10万[1]。1927年Fanconi首次报道3例儿童再生障碍性贫血合并多发性先天畸形病例，故名为范可尼贫血[2]。
FA中位发病年龄为7岁，9%的FA患者直至成年期才被确诊，也有直至49岁才发病的患者，男：女约为2：1[3]。目前，已经发现FANC -A、FANC -B、FANC -C、FANC - D1(BRCA2)、FANC -D2、FANC -E、FANC -F、FANC -G(XRCC9)、FANC -I( KIAA1794)、FANC -J(BRIP1)、
FANC -L(PHF9/POG)、FANC -M(HEF)、FANC -N(PALB2)、FANC -O(RAD51C)、FANC -P (SLX4)、FANC -Q(XPF/ERCC4)、FANC -R( RAD51)、FANC -S(BRCA1)和FANC - T( UBE2T)等19个基因的异常可以造成FA，其中FANC -A突变最多见，约占70%，其次为FANC -C和FANC -G突变[4]。这些基因编码的蛋白质参与了FA/BRCA功能网络，该功能网络与3条经典的基因损伤后DNA修复路径相关，分别是同源重组、核苷酸切除修复和经诱变的跨损伤DNA复制[5]。在射线、有毒化学物质、细菌和病毒感染造成DNA损伤后，该损伤不能得到及时修复，造成突变的累积。由于人体造血系统处于相对活跃的增殖状态，这些DNA损伤后易导致造血系统受累，表现为造血系统增殖低下，远期极易发生血液和其他系统的恶性转化[6]。
二、临床特征
FA是一高度异质性的疾病，且疾病呈进展性，造成其临床表现多样化。部分患者可仅有骨髓衰竭而无躯体畸形，或只有躯体畸形而无血液系统异常；患者常有阳性家族史，其自身和（或）家族成员恶性肿瘤发生率较高。
1、血液系统异常
一项来源于国际FA登记处(International Fanconi Anemia Registry，IFAR)的大样本研究显示，截至40岁，90%的FA患者会进展至骨髓衰竭，骨髓衰竭发生的中位年龄为7岁[7,8]。血小板减少常出现于红细胞和（或）中性粒细胞减少之前，且与患者体内胎儿血红蛋白增多相关。
2、先天畸形
在已报道的FA患者中，近2/3有先天性躯体畸形表现[9]。
(1)皮肤色素沉着：51%～80%有皮肤色素异常沉着，典型表现为褐色沉着斑，或色素沉着与减退相混杂，呈“牛奶咖啡斑”[10]。
(2)骨骼畸形：以多指及拇指异常多见，常有桡骨缺失或发育不良；骨骼发育不良还可见于下肢，脊柱畸形少见[10]。
(3)内脏畸形：以肾脏为主，多见异位肾、马蹄肾、肾脏发育不良或肾缺如；可有心、肺及胃肠道畸形[10]。
(4)视觉及听觉异常：先天性白内障、眼睑下垂、斜视；传导性失聪、骨膜缺如或融合等[10]。
(5)神经系统异常：小脑畸形，先天性脑积水，贝尔氏麻痹，单侧脑室等[10]。
3、生长及生殖发育异常
在IFAR的大样本研究中，FA患者的平均身高、体重及头围均接近正常人群的第五百分位，身材矮小常继发于生长激素及甲状腺素缺乏或不敏感，营养不良则与胰岛素缺乏或不敏感相关。女性FA多有初潮延迟、绝经期提前，近半数不孕；其中，16岁前未接受性激素替代治疗的女性FA患者中，仅有15%能够顺利生育一胎及以上[11]。男性精子成熟障碍则更为多见，仅有个别病例报道男性FA患者成功育有下一代[12]。
4、肿瘤易感性
至少20%的FA发展为恶性肿瘤，40岁时发生血液系统肿瘤和非血液系统肿瘤的风险分别为33%和28%[8]。最常发生的血液系统恶性肿瘤为骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)，其中白血病发病的中位年龄为11.3岁[13]。骨髓造血细胞遗传学检查出染色体lq易位、单体7/7q -或3q+染色体异常高度提示有发生AML或MDS的危险[8]。FA患者亦容易罹患实体瘤，以头颈部鳞状细胞癌最为常见，发病风险为普通人群的500～700倍，40岁时累计发生率高达14 %[8]。国外一项研究显示，FA患者发生HPV相关癌变及头颈部肿瘤风险增高，可能与p53在HPV相关原癌基因编码的蛋白作用下失活有关，而不是基因直接突变的结果[14]。流行病学分析表明，随着非同胞供体移植的推广，越来越多的FA患者得到及时的异基因造血干细胞移植(Allogenetic hematopoietic stem cell transplantation，Allo - HSCT)治疗，使得该疾病人群存活时间大大延长，这必将增加未来FA患者中恶性肿瘤的发生率。
三、诊断
FA的临床诊断主要依据完整的病史，临床表现和相应的实验室检查，其中完整的病史包括患者的个人病史及其家族史，当近亲及家族成员出现贫血、血小板计数减少、躯体畸形、头颈部肿瘤等均有助于该疾病的诊断。由于FA是一高度异质性疾病，FA的实验室诊断已成为临床诊疗工作的重要支持。
1、染色体断裂试验
将FA患者的细胞暴露于双环氧丁烷(diepoxybutane，DEB)和丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)等DNA交联剂中，以出现大量的染色体异常，尤其是当染色体断裂和环状染色体形成时则为阳性结果[15]。DEB诱导的染色体断裂试验已广泛用于FA的初筛。
2、基因测序分析
近年来，基因检测广泛用于FA的诊断及分型，这种方法不仅可以发现新的突变基因，而且所检测出的杂合突变基因对FA患者或FA基因携带者具有一定的临床意义[16，17]。随着对FA疾病分子机制探索的深入，已发现19种已知致病基因( FANC -A、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、M、N、0、P、Q、R、S和FANCT)，存在19种相应的FA疾病类型[4]。近年来，利用下一代测序技术( next-generation sequencing，NGS)，结合微阵列技术而衍生出来的目标序列捕获测序技术，为临床提供了较快速、准确、廉价的诊断方法[16,18]。国内的上海儿童医学中心自2009年起建立了基于NGS技术的遗传性血液分子诊断panel，该panel涵盖了当前几乎所有血液系统遗传性疾病，其中就包含了与FA相关的基因。研究发现，即使是同样亚型的FA患者其临床表现和预后也有差异，而且单个基因突变也不能解释FA患者的临床表型[19]。FANCC、BLM、BRCA2突变的FA患者乳腺癌发生风险明显增高[20,21]；FANCD2杂合突变者更容易发生T细胞白血病和精原细胞瘤[22]。分子诊断技术的进步带来更多新突变的发现，某些突变尚未确定是否与发病有关，或尚未在相关数据库中出现，结果不能得到科学合理的解释，故需要临床医生积累相关资料、对病患者长期随访、结合实验室研究工作中对突变蛋白功能的预测和家系验证，为FA基因数据库中提供更加全面的数据，服务于今后的FA诊断。
3、Western方法检测FANCD2蛋白的泛素化
FANCD2蛋白在K561位点赖氨酸的单泛素化修饰是FA途径发挥作用的关键环节[23]。通过Western方法检测FANCD2蛋白是否发生泛素化可以用于FA的诊断。该检测方法与基因测序相结合可以对FA做出较全面的诊断，尤其是临床表现不典型但又怀疑为FA的患者。目前国内此项检测多用于实验研究，一些公司也开始进行这项检查，但由于费用昂贵在临床上还没有得到推广。随着对FA途径蛋白复合物研究的深入，不断有新的与FA途径相关的蛋白被发现，并从泛素化、磷酸化等角度研究这些蛋白在细胞周期、DNA损伤、肿瘤发生等FA途径相关生物学事件中的分子调控机制[24]。通过实验发现更有效的介导FA发生的分子靶点，将会为FA患者提供更加直接和准确的诊断方法[24]。
4、其他
将可疑FA患者外周血淋巴细胞暴露于交联剂后，采用流式细胞学检测细胞周期，FA细胞的G2/M期较正常细胞延长[25]。该方法多用于实验室，极少在临床诊断应用。
四、鉴别诊断
1、获得性再生障碍性贫血
该疾病一般不合并先天畸形，无明显智力发育落后，骨髓抑制常更为严重。
2、增生减低型骨髓增生异常综合征
该疾病的典型特征是外周血三系下降，骨髓培生可活跃，骨髓中有一系以上的病态造血，不伴先天畸形，无明显智力发育落后；染色体断裂试验及基因检测可与FA鉴别。
3、其他类型的先天性骨髓衰竭综合征
五、治疗
骨髓衰竭常成为FA患者最先出现、最具特点的临床表现，恢复骨髓造血功能是挽救FA患者生命的关键。
(1)雄激素对部分FA患者的骨髓衰竭有一定作用，但无法根治，如羟甲烯龙和达那唑，常用于无条件获得合适的异基因造血干细胞移植治疗的患者。研究显示，50%～70%的FA患者对雄激素疗法有反应[26]；经雄激素治疗的FA患者随访10年，累计生存率为76%[4]。长期使用雄激素会引起多种不良反应，如多毛症、肝脏肿瘤发生和行为异常等[4]。
(2)造血干细胞移植是根治FA患者骨髓衰竭的唯一方法[3,27]。FA患者对DNA交联剂高度敏感，当细胞暴露于环磷酰胺等毒性药物时会增加染色体断裂和组织损伤，早年的清髓性预处理方案造成了过多预处理相关毒性死亡，因此该类患者需要采用降低强度的预处理方案[28]。Gluckman等采用以福达拉滨为基础的减低剂量预处理，使FA患者的移植后生存率上升至85%，但长期随访发现罹患肿瘤的风险急剧升高，肿瘤高峰出现在移植后8~9年，更有报道随访20年肿瘤风险达40%[28]。移植相关毒性反应包括由放化疗所致的物理损伤、移植物抗宿主病、免疫损伤、不育症和内分泌疾病等。未来的移植学工作将进一步完善预处理方案探究，在保证成功植入的前提下尽量减少这些毒性反应的发生[3,8]。
《FA诊疗指南》中对骨髓衰竭的治疗建议如下[29]：首先根据患者的中性粒细胞计数、血小板计数和血红蛋白含量分为轻、中、重3型，再根据不同类型进行治疗选择。比如当中性粒细胞计数＜1*109/L，血小板计数＜50*109/L，血红蛋白量＜80g/L时定义为中度骨髓衰竭；在条件允许时可以进行造血干细胞移植治疗。
(3)诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）疗法：向FA患者移植cDNA-相关的iPSCs可能成为治疗FA的方法，这种方法可能会克服传统基因治疗的局限性和造血干细胞移植相关并发症[30]。但该方法尚处于临床试验阶段，其临床应用还存在诸多问题，如致癌基因和病毒介导基因的插入可增加肿瘤风险。从iPSCs成功诱导出血细胞的前体细胞，成为长期的造血干细胞，并用于FA患者的移植将成为一项挑战性工作[31]。
六、典型病例
患儿，男，8岁，来自安徽巢湖。4岁起因“面色苍白、乏力1周”至南京一医院就诊，查血常规示三系下降，骨髓细胞学检查提示“粒系增生减低，红系增生活跃，巨核系增生减低”，诊断再生障碍性贫血，予口服十一酸睾酮及环孢素，6岁起病情加重，依赖输血。7岁起至我院门诊就诊，骨髓细胞学检查结果同前，但因发现患儿有先天性右手拇指畸形（见图1），双眼裂小、下巴小，身材矮小，身高120cm，体重18.8kg，我院基因测序示患儿FA基因存在两处遗传性变异（FANCG：c.1652-1653 Tins, FANCG: c.91C>T; p. Q31X），一处造成蛋白结构移码，一处造成蛋白质翻译提前终止，均严重影响了FANCG蛋白的功能。此两处变异分别来自患儿的母亲和父亲（见图2和图3），追问病史患儿哥哥3岁确诊为再生障碍性贫血感染死亡。
确诊FA后，患儿于2015年寻得中华骨髓库HLA 8/10相合非亲缘供体，接受以福达拉滨为基础的减低剂量预处理后行外周血造血干细胞移植。患儿移植后 + 14 d 粒细胞及血小板均重建，移植过程顺利。现患儿能正常学习及生活。